凝血检测及质量控制

凝血检测及质量控制,1,历史记载,公元前犹太人的法典中 即有有关血友病的记载近代欧洲王室之间相互 通婚，造成各国王室中血友病患者高发,2,止凝血障碍与各种常见病,血液系统疾病心血管疾病糖尿病肾脏疾病妇产科疾病外科手术体外循环等,心肌梗死,凝血功能异常,3,血管中流动的血液为什么不凝固破损的血管为什么能止血,机体内存在着复杂的凝血系统和抗凝系统,凝血血栓,抗凝出血,一 凝血基础理论,4,正常止血机能,两方面,五因素,凝血机制,抗凝机制,血管壁（vessel wall）,血小板（platelet）,凝血系统（coagulation system）,抗凝系统（anticoagulation system）,正常止血机制,纤溶系统（fibrinolytic system）,5,1、血管壁的作用,血管受损 血管收缩(1) 止血 血液粘稠(4) 止血 内皮细胞 PLT黏附聚集(2) 止血 TXA2 5-HT 释放暴露内皮下胶原 激活(3) 内源性凝血 止血 TF释出 外源性凝血 止血,神经反射,内皮素 血管紧张素,vWF,6,Vascular injury,FgCa2+,platelet,TF,a-TF - Ca2+,FIBRIN CLOT,Fibrinogen,1、血管壁的作用,7,血管受损 vWF 血小板黏附（1） PLT聚集()（2） Fg PLT释放(5-HT ADP)（3） GP IIb/IIIa Fg 血管 加速 (） 加速a 使纤维蛋白 收缩 聚集 形成（2） 网收缩（4）,2、血小板的作用,8,Vascular injury,2、血小板的作用,粘附,聚集,释放,9, 纤维蛋白原 凝血酶原 组织因子 钙离子 易变因子 不存在 稳定因子 抗血友病因子 Christmas因子 Stuart-Power因子 血浆凝血活酶前加速素 Hegeman因子XIII 纤维蛋白稳定因子PK 激肽释放酶原HMWK 高分子量激肽原,目前公认的凝血因子共14个，按罗马字命名的有12个，及高分子量激肽原(HMWK)，激肽释放酶原(PK)大多数由肝脏产生，其中II、VII、IX、X合成依赖Vitk，称Vitk依赖因子除TF外，都存在于血浆除FIV（Ca2+）外均为蛋白质正常情况下，所有因子都处于无活性状态,3、凝血因子机制,10,凝血机制（瀑布学说）,Intrinsic pathway,extrinsic pathway,common pathway,K,PK,HMWK,三个阶段凝血酶活酶形成凝血酶形成纤维蛋白形成,两途径,11,正常的止血凝血机制,12,4 、抗凝系统,抗凝血酶系统 ：AT-，肝素 -丝氨酸蛋白酶抑制剂，灭活a、a、a、a及凝血酶等蛋白C系统：蛋白C、蛋白S、血栓/凝血酶调节蛋白(thrombomodulin ,TM) -使凝血因子Va, VIIIa失活; -TM与凝血酶结合，促凝转向抗凝TFPI(tissue factor pathway inhibitor) -抑制VIIa/Xa,13,抗凝系统作用,AT- TFPI 肝素a a a a a K a a TF/a肝素辅因子(Hc-) APC +PS 激活纤溶 a/TM PC,（肝和内皮细胞合成）,TFPI组织因子途径抑制物AT-抗凝血酶Pc、PsTM血栓调节蛋白,Ca2+,14,分解清除纤维蛋白（原），保持血流通畅组成 纤溶酶原（plasminogen, plg） 纤溶酶（plasmin，pln） 纤溶酶原激活物(plasminogen activators, PAs） 纤溶酶原激活物抑制物 (PAIs) 纤维蛋白原(Fbg) 纤维蛋白(Fbn) FDP(fibrin degradation product),5、纤维蛋白溶解系统(纤溶),15,纤溶系统,纤溶酶原激活物t-PA u-PA a K a （+） 纤溶酶原 纤溶酶 PL 纤溶酶抑制物 （+） 水解 X纤维蛋白及 纤维蛋白纤维蛋白原 降解产物 D-D等,PLG,血小板聚集,（-）,（-）,二个阶段纤溶酶原激活-纤维蛋白降解,外激活途径,内激活途径,最重要的生理性抗凝系统,16,纤维蛋白原 纤维蛋白单体 稳固纤维蛋白 纤溶酶 纤溶酶 纤溶酶 B1-42 B15-42 D二聚体、多聚体A、B、C、H A、B、C、HX、Y、D、E X、Y、D、E X、Y、D、E 被降解的纤维蛋白（原）产物统称为FDP,17,止凝血障碍性疾病的发病机制,血管壁结构与功能异常血小板质与量异常凝血因子质与量异常循环中抗凝物质增加纤溶系统异常综合因素,一期止血缺陷,二期止血缺陷,纤溶系统缺陷,18,二、凝血障碍的实验检测,19,凝血障碍的实验检测,血管壁的检查血小板数量和功能的检查血小板数量：血小板计数、形态血小板功能：血小板粘附、聚集血小板相关抗体凝血因子 内源性：APTT测定外源性：PT测定因子活性测定抗凝蛋白测定：AT-测定，PC测定纤溶系统检查：FDP,D二聚体，3P试验-初筛试验/诊断试验,20,（一）血管壁检测,初筛试验出血时间测定（BT）束臂试验诊断试验血管性血友病因子检测,21,诊断试验血管性血友病因子检测,血管性血友病因子（活性/抗原检测） 免疫火箭电泳法 酶联免疫法临床意义减低：血管性血友病（VWD）增高：血栓性疾病,22,（二）血小板检测,血小板计数血块收缩试验血小板功能血小板粘附试验血小板聚集试验血小板相关免疫球蛋白,23,诊断试验血小板聚集试验,参考值：临床意义：增高：血栓前状态和血栓性疾病，如急性心梗，心绞痛，脑血管病，深静脉血栓形成，口服避孕药等减低：血小板无力症，原发及继发血小板疾病，血管性血友病，应用抗血小板药等,24,诊断试验血小板相关免疫球蛋白（pAIg）,血小板相关免疫球蛋白（platelet associated Ig，PAIg）,又称血小板相关抗体pAIg增高免疫性血小板减少的共同特征自身抗体（最多90%）如ITP、SLE、类风湿同种抗体如大量输血或血小板、新生儿免疫性血小板减少症免疫复合物相关抗体药物性、败血症及AIDS等,25,（三）凝血因子检测,凝血时间（CT）活化部分凝血活酶时间(APTT)凝血酶原时间(PT)纤维蛋白原(FIB)凝血酶时间(TT),26,初筛试验活化的部分凝血活酶时间（Activated Partial Thromboplastin Time, APTT）,27,临床意义,延长：内源因子缺陷(、)：血友病A、B，因子XI缺乏 共同因子缺陷：FV、FX、凝血酶原、纤维蛋白原严重肝病、DIC 循环中抗凝物质增多普通肝素应用的首选指标使APTT延长1.5-2.5倍缩短：高凝状态脑血栓、心梗、DIC高凝期,28,初筛试验血浆凝血酶原时间（Prothrombin Time; PT）,29,世卫组织将人脑凝血活酶标准品作为制备不同来源凝血活酶的参考物，ISI表示标准品与每一批凝血活酶PT校正曲线的斜率，越小试剂越敏感,30,临床意义,延长：先天性凝血因子异常：、因子缺乏后天性凝血因子异常：严重肝病、VitK缺乏、纤溶亢进、DIC后期、使用抗凝药物如双香豆素缩短：DIC、心梗、脑血栓、血栓性静脉炎、MM、乙醚麻醉后,31,血浆凝血酶时间（Thrombin Time TT）,原理：血浆+凝血酶纤维蛋白形成1618s超过正常对照3s为延长,血浆,标准凝血酶,延长：纤维蛋白原质与量异常FDP增多，如纤溶亢进循环抗凝物质增多，如AT-、肝素样物质 异常球蛋白增多，如MM,32,纤维蛋白原测定,减低：肝脏疾病 原发性纤溶亢进 低或无FIB血症 溶栓治疗等增高：血栓前状态或血栓性疾病： 急性心梗、脑梗 糖尿病、妊高征 外科手术后 多发性骨髓瘤等,33,诊断试验凝血因子活性/抗原测定,增高:血栓前状态和血栓性疾病，如肺栓塞、妊高征、晚期妊娠、肾病综合征、恶性肿瘤等 减低: FC减低血友病A、vWD、F抗体、DIC FC减低血友病B、肝脏病、维生素K缺乏症、DIC、口服抗凝药物FC减低因子缺乏症、肝脏疾病、DIC等,34,（四）抗凝血功能检查,血浆抗凝血酶活性(AT-:A)临床意义增高: 血友病、白血病和再障等急性出血期及口服抗凝药物治疗中。减低: 先天性和获得性AT-缺乏症 血栓性疾病、DIC和肝脏疾病等血浆蛋白C活性测定临床意义减低：先天性或获得性PC缺乏症 DIC、肝病、手术后、口服抗凝剂、急性呼吸窘迫综合征,35,（五）纤溶系统检查,血浆纤维蛋白（原）降解产物D-二聚体测定3P试验,36,血浆纤维蛋白（原）降解产物 （Fibrin(ogen) Degradation Products, FDP）,临床意义：继发性纤溶增强，如DIC、严重感染、恶性肿瘤、大手术后、深静脉血栓、肺梗塞、溶栓治疗期原发性纤溶时FDP亦显著增高,原理：胶乳比浊法,37,D-二聚体测定（D-dimer）,交联纤维蛋白降解的特异产物参考范围：20400gL 500gL 有临床意义,38,临床意义深静脉血栓、肺梗塞、继发纤溶亢进(DIC)-D-D显著增高凡有血块形成的出血增高D-D正常-排除深静脉血栓形成DIC-常2000g/L以上，敏感性可达100%溶栓治疗：溶栓治疗时FDP和D-D增高溶栓完全后D-D下降，但FDP并不下降原发性纤溶亢进D-D不增加,39,血浆鱼精蛋白副凝试验（plasma protamine paracoagulation test，3P试验）,原理与方法,阳性-FDP、FM增多DIC/继发性纤溶亢进 溶栓治疗后大出血（创伤、手术、咯血、呕血），恶性肿瘤、人工流产等原发性纤溶、DIC晚期阴性,40,弥漫性血管内凝血(DIC)的检测,定义：多种致病因素导致全身微血管内微血栓的形成，消耗大量的血小板和凝血因子，并引起继发性纤溶亢进，造成血栓出血综合征实验室检测：(同时有三项以上的异常)血小板计数(100109L或进行性下降)血浆纤维蛋白原含量(1.5g/L或进行性下降或4g/L)3P试验阳性或FDP20mg/L或D-二聚体水平升高或阳性PT缩短或延长3秒以上(肝病延长5秒以上)或呈动态变化APTT缩短或延长10秒以上纤溶酶原含量及活性减低200mg/LAT含量及活性降低60%或蛋白(PC)活性减低,41,Overt-DIC评分系统,是否有引起DIC的基础疾病,评分,停止,否,是,D- dimer增加 正常或略增加,42,检测项目的选择和应用,一期止血缺陷的选择：BT、PLT二期止血缺陷的选择：PT、APTT纤维蛋白溶解综合征：FDP、DD血栓前状态抗栓治疗的监测：肝素：APTT 口服抗凝剂：PT 溶栓治疗：DD等,43,检查项目的选择及应用,为血管和血小板缺陷所致的疾病,一期止血缺陷(血管损伤小),44,检查项目的选择及应用,内源： 外源： 共同：,二期止血缺陷(血管损伤较大),45,检查项目的选择及应用,抗凝治疗的实验室监测抗凝疗法阻止血液凝固，防治血栓栓塞性疾病广义的抗凝包括：预防血栓形成的药物疗法若已形成血栓溶栓治疗肝素：首选APTT(1.52.5倍)；血小板计数华法令：首选PT，以INR(国际标准化比值) 2.02.5,3为界抗血小板药口服有效，可长期服用，疗效持久、确切，一般无出血危险，故无需常规进行实验室监测必要时监测血小板聚集功能,小剂量即50mg或75mg，q12h，无需监测,46,应用Warfarin时INR值的允许范围,47,三 凝血检测的质量控制,48,分析前质量控制,标本的采集1 时间：清晨空腹，病人服药情况2 采集容器3 技术要点：止血带压力 束缚时间 采血顺利 避免组织因子污染，溶 血， 凝血，气泡产生4 颠倒混匀，避免用力振荡破坏凝血蛋白,49,抗凝剂的选择与使用1 抗凝剂的比例2 充分混匀，避免气泡产生及自身污染3 血细胞比容的影响： 严重贫血者(Hct0.55) 调整比例：用量(ml)0.00185全血量(ml)(1-Hct),分析前质量控制,50,标本的保存与处理1 温度： 4或20，全血室温放置不超过2小时2 血浆分离：最好1小时之内3 冷冻血浆：37水浴中快速解冻，不能再次冷冻4 血浆制备：富血小板血浆 乏血小板血浆5 试管加塞6 分离血浆用塑料吸头,分析前质量控制,-20-2周-80-18个月,51,分析中质量控制,实验人员规范操作,室内质控,试剂,仪器,分析中质量控制,52,分析中质量控制,仪器 1 环境 2 调试与校准 校准的要求 校准的频率 3 参数的设置 4 准确度 携带污染率 5 保养和维护,53,试剂1 选择：与仪器匹配，质量可靠、性能稳定2 保存：按说明保存，冰冻保存的试剂不能反复冻融3 有效期4 不同厂家，不同批号的试剂、新旧试剂不能混用。 5 试剂溶解6 清洗液：4h更换一次,分析中质量控制,54,室内质量控制1 质控品的选择2 质控的频度与方法3 靶值确定4 质控图及质控规则5 失控处理,分析中质量控制,55,分析后,报告运送及临床反馈,室间质量评价,室内质控的数据管理,病人投诉处理,分析后质量控制,56,57,病例分析,陈某，女，89岁。 因肺部感染入院，呼吸科行常规治疗后无明显诱出现右上肢血肿瘀斑9天，转入血液内科，查体可见右上肢自肩峰至肘关节下肿胀，内侧重，发紫，表面有张力性水疱，有触痛，质韧，肘关节活动受限。患者血压无法测量，神清，皮肤巩膜无黄染，浅表淋巴结无肿大，唇无紫绀。 B超示胸腔包裹性积液9/3实验室检查示：PT 14.1s，APTT 77.6s，TT 13.2s，Fib 2.35g/LF:C 124.2%, F:C 1