烟叶表面高效降解蛋白质芽孢杆菌的分离筛选及其鉴定

冯志珍等烟叶表面高效降解蛋白质芽孢杆菌的分离筛选及其鉴定 101 烟叶表面高效降解蛋白质芽孢杆菌的 分离筛选及其鉴定 冯志珍 ，陈太春 ，胡喜怀 ，郭志刚 ，安德荣 1西北农林科技大学植物保护学院，陕西省农业分子生物学重点实验室，杨凌712100； 2陕西中烟工业有限责任公司，西安710065 摘要：利用芽孢杆菌耐高温的特性，从烟叶表面分离筛选并得到1株可高效降解蛋白质的菌株FY一11，其蛋白质降解圈直径与菌 落直径比值(HC值)为550，蛋白酶活力为2567 u。通过形态学特征及生理生化特征鉴定菌株FY一11为芽孢杆菌属。将其制成 菌剂对烟丝进行发酵，测得蛋白质降解率为2932。 关键词：烟叶；生物降解；芽孢杆菌 doi：103969jissn1004-5708201201017 中图分类号：$4324 文献标识码：A 文章编号：1004-5708(2012)O1-0101-05 solation，screen and identification of Bacillus with high proteolytic activity frOm tobacco leaf surfaces FENG Zhizhen ，CHEN Taichun ，HU Xihuai ，GUO Zhigang ，AN Derong 1 College of Plant Protection，Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture， Northwest A&F University，Yangling 7 1 2 1 00 Shannxi，China； 2 China Tobacco Shaanxi Industrial CoLtd，Xihn 710065，Shannxi，China Abstract：A strain called FY一1 1 was isolated and screened from tobacco leaf surfacesIts HC value，ieratio of colo ny diameter to protein degradation circle diameter，is 550 and proteolytic activity 2567UFY一1 1 strain was identified as bacillus by morphological，physiological and biochemical characteristicsBacillus agent was prepared to ferment cut tobacco and resulted in a 2932of protein degradability under certain conditions Key words：tobacco leaf；biodegradation；bacillus 1967年，Ratnavathi首次对烟叶香气有关的化学 物质进行分析测定，大致分为酮类、醇类、脂类、烯酸、 氨基酸糖、氨基酸酮、类胡萝卜素、烯醇类、酚类等 。 烟叶中蛋白质适量可增加香味，过多则产生辣味。发 作者简介：冯志珍(1986一)，硕上研究生，研究方向为微生物资源利 用，Email：fzz870508126con 通讯作者：安德荣(1963一)，教授，博十生导师，研究方向为微生物资 源利用及植物病理研究，Email：anderong323163con 基金项目：冈家“863特殊生物资源开发和利用项目” (2007AA021503)，陕西中烟 _r= 公司生物发酵增香减害项 (2010182) 收稿日期：20110508 酵过程中，烟叶中的蛋白质可在蛋白酶作用下分解为 多种氨基酸，可增加烟叶内香气的前体物质 。 研究表明，在烟叶发酵过程中，微生物的生长代谢 所产生的许多次生代谢产物对烟叶的化学成分的变化 起着催化作用，促进大分子化合物转化和增香物质的 产生_3，o J 利用有益微生物及其代谢产物对烟叶进行 发酵，调节烟叶内生理生化代谢过程，改善烟叶化学成 分，提高烟叶香气，已成为烟草科技开发的重要课 题 。本研究从云南、陕西各地烤烟表面分离得到 l株降解蛋白质效率较高的菌株，具有潜在的应用价 值。 102 中国烟草学报2012年2月第18卷第1期 1材料与方法 11试验材料 烟叶样品由陕西巾娴公司提供，供试烟叶见下表。 表l 供试烟叶样品 12培养基 本试验所用培养基有蔗糖豆芽汁培养基、奶粉豆 芽汁培养荩、改进豆芽汁培养基 “ 。 13试验方法 131 芽孢杆菌的分离、培养及菌J军建立 1311 增殖培养 将烤 I剪碎放入100 mL一角瓶中，加入约30 mL 水，加棉寒，煮沸后维持30 rain，放人30恒温培养箱 中培养2448 h。 1312芽孢杆菌的分离 用接种环取增值培养液液面皮膜适最，或用移液 枪吸取50 Ixm增值培养液，于无菌水中充分稀释(本 试验稀释至1O一 )，再以稀释涂抹法接种于蔗糖豆芽 汁培养基，于30C下培养24_48 h。 1313构建娴叶表面芽孢杆菌菌库 将分离得到的炯草表而芽孢杆菌纯化保存在4c【= 冰箱巾，按照菌种来源及分离先后顺序统一编号，构建 烟叶表面芽孢杆菌菌库，共计分离得到芽孢杆菌239 株。 132初筛 将芽孢杆菌菌种活化，挑取小同典型菌落接种于 奶粉豆芽汁培养摹，30恒温培养箱中培养2448 h， 在菌落周H爿有透明 产生，证明该菌产蛋白酶。用游 标 分别测量透明圈直径与菌落直径，根据两者比 值(HC值)大小初步确定蛋白酶活性的高低。 133蛋白酶活力测定 酶活单位定义：l mL液体酶在一定温度和pH值 下，1 min水解酪蛋白产生l g酪氨酸为1个酶活力 单位，以“UmL”表示。 1331生长曲线的测定 将活化后的菌株(优势菌株)以5接种量接入液 体发酵培养基，放入30、200 rrain摇床培养。于5 h、10 h、22 h、27 h、32 h、44 h、49 h、54 h吸取菌液，用 紫外分光光度讣测660 nm下菌液的OD值并记录，做 3个平行，1个空白对照。以时问为横坐标，OD值为 纵坐标绘制生长曲线。 1332粗酶液的制备 将菌种以5接种量接种于液体发酵培养基， 30、200 rrain摇床培养至各菌株对数生长期。发酵 液于4200 rrain离心15 min，取上清液则为粗酶液。 (沣：粗酶液应马上使用，若暂不使用，应置于4冰箱 冷藏，以免失活。) 1333酶活，J测定 采用国家标准中的蛋白酶活力测定法 J。 134烟叶中蛋白质含 的愉测 1341 芽孢杆菌菌剂刘 f 的发酵处理 (1)芽孢杆菌菌剂的制备 将供试菌株接种到蔗糖豆芽汁培养基活化，挑取 适量接种于液体发酵培养基，30C、120 rmin振荡培 养24 h，培养液以4000 rmin离心10 min，沉淀用无菌 水洗涤，离心2次，使用前用无菌水配成菌悬液，稀释 浓度为3010 cfumL 。 (2)烟丝发酵 将烟丝平衡水分至12左右，每个处理称取烟丝 100 g，将制备好的芽孢杆菌菌剂用无菌小 喷雾器均 匀喷淋烟丝，喷施量为10 mL菌悬液100 g烟丝，对照 用无菌水处理。混匀后装入食品袋内，置于气候箱内 发酵15 d，发酵温度保持30T：，相对湿度65-70。 1342发酵后烟丝内蛋白质测定 H 参照国家=J=lj=I草和烟草制品总蛋白质含晕的测定标 准方法。 135菌种鉴定 对复筛后的优良菌株，根据其形态和生理生化特 征，参照伯杰氏细菌手册和常见细菌系统鉴定手 册，进行菌种鉴定。 136统计分析方法 试验数据处理采用SPSS160统计分析软件进行。 冯志珍等烟叶表面高效降解蛋白质芽孢杆菌的分离筛选及其鉴定 103 2实验结果与分析 21初筛结果 经过初选，共得到57株菌落周围具有透明圈的芽 孢杆菌，说明其具有分泌蛋白酶的特性。分别测量产 蛋白酶芽孢杆菌的透明圈直径和菌落直径的比值(培 养36 h后)，结果见表2。 表2 不同菌株产蛋白酶活力部分初筛结果 往：表中数据为3次熏复平均值。同列数据后不同 母表示在l 水平差抖 著。 由表2可见，菌株编号为FY一11、FY一16的透明 圈直径与菌落直径的比值较大，分别为550和470。 虽然透明圈的大小直接反映了酶浓度的高低，但不能 完全代表菌株的产酶能力，其原因是多方面的：固体和 液体培养基条件不同、不同菌株具有不同的生长和产 酶速度及淀粉酶酶系、菌苔大小及在平板上堆积情况 的差异等都会造成透明幽大小不同，所以液体发酵复 选必不可少。 22蛋白酶活力测定结果 对初筛透明圈直径和菌落直径的比值较大的10 株芽孢杆菌进行液体发酵培养试验，采用国家标准中 的蛋白酶活力测定法对发酵培养粗腑液蛋白酶活力进 行精确测定，结果见表3。 表3 不同菌株产蛋白酶活力部分复筛结果 注：表中数据为3次草复平均值。同列数批后不同字母表示 ：1 水平差异显并。 图1 不同菌株对蛋白质的降解效果 酶活力最高的是编号为F Y一1 1、FY一16的菌株， 酶活力分别达2567U和2347U，其余菌株中相对较 优的还有FY12、FJ一1 2、FL一1菌株，它们的酶活分别 为2312U、1950U、1513U，与初选结果一致。 23发酵后烟丝内蛋白质含量测定结果 芽孢杆菌菌剂发酵烟丝后，烟丝内蛋白质含量变 化结果见表4。 表4发酵后烟丝内蛋白质含量 注：lJJ表尔细菌菌剂处 ，CK表尔川无 水处删烟丝。 104 中国烟草学报2012年2月第18卷第1期 由表4可知，烟丝经芽孢杆菌菌菌剂处理后，烟丝 内蛋白质含量均降低，不同菌剂处理与对照处理的蛋 白质含量相比，蛋白质降解率均达20以上，其中F Y一11效果最佳，降解率高达2932。 24菌种鉴定结果 通过对F-Y一1 1菌株的个体形态、菌落形态和生理 生化特性的检测，初步鉴其为芽孢杆菌属(Bacillus)。 在LB培养基上，菌落为浅黄色，不透明，呈圆形，表面 有明显光泽，边缘整齐，表面无褶皱，具有一定的粘附 性，易于挑起。革兰氏染色为阳性，菌体呈杆状，两端 钝圆，大小为06-08 m2458 m，芽孢中生，椭 圆状、无荚膜。其生化性状见表5。 表5菌株FY一11的生理生化特征 注：“+”表 刚 反J、 ，“一”表不I 代反应。 3结论与讨论 通过蛋白质降解圈与菌落直径比值初筛，以及蛋 白酶活力测定复筛，得到1株可高效降解蛋白质的菌 株FY一1 1，在未作发酵培养基及发酵条件优化的前提 下，酶活力为2567 u，经形态特征和生理生化特征初 步鉴定其为芽孢杆菌属。 将菌株FY1 1制成芽孢杆菌菌剂，施于烟丝上进 行发酵后，烟丝蛋白质含量较对照降低了近30。蛋 白质降解，氨基酸含量增加，据报道可增加烟丝内香气 的前体物质 。 应用微生物处理烟丝，增加烟丝香气，改善烟丝品 质，其机理较为复杂，有待进一步研究。 图2透射电镜和扫描电镜下F-Y-l1菌株形态 参考文献 1 刘萍烟叶增香细菌的筛选及其对烟叶品质影响的研究 D山东农业大学，2003 宋朝鹏，丁云生，李少鹏，等微生物制剂对上部烟叶蛋白 质及中性香气含量的影响J安徽农业科学，2009，37 (3)：11471159 周谨，李雪梅，许传坤，等利用微生物发酵改良烤烟碎片 品质的研究J烟草科技，2002，(6)：6467 谢会雅，朱列书，牛艳丽，等利用酶制剂降解烤烟烟叶中 淀粉和蛋白质的研究J中国烟草科学，2008，29(6)： 2326 朱大恒，陈锐，陈再根，等烤烟自然醇化与人工发酵过程 中微生物变化及其与酶活性关系的研究J中国烟草学 报，2001，7(2)：2630 邓小华，周冀衡，陈新联，等烟叶质量评价指标间的卡H关 性研究J中国烟草学报，2008，14(2)：18 Deborah ARathbone，Neil CBruceMicrobial transfor mation 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