论文螺旋藻抑菌活性成分研究

晋中学院生物科学与技术学院 2015 届毕业论文（设计）01 前言1.1 螺旋藻简介螺旋藻(Spirulina)属蓝藻门（cyomophyta）颤藻科（Oscilatori-aceae），又称为蓝细菌 1。是一种螺旋丝状、能够进行自养的多细胞藻体,其分布较广,可生长在土壤、沼泽、淡水、盐水、海水和温泉中,甚至在一些不适应其它生物生存的环境,如含高碱量的湖泊中也能很好地生长 2。螺旋藻含有大量的活性物质,如蛋白质、多糖、粗脂肪、酚酸、维生素等 3，能够广泛应用于医药、食品、能源、环境、动物饲料等领域 4。目前，对螺旋藻的应用主要集中在营养价值、医药效用、动物饲料等。近年来的大量研究表明，螺旋藻由于营养价值高、医疗保健功能突出，已经被广泛应用于食品、制药工业。有学者研究指出 5，螺旋藻中蛋白质的含量高达 5570% ，氨基酸组成比例十分合理。刘志伟 6介绍，多糖是螺旋藻抗疲劳作用的主要成分，它能减少蛋白质和其他含氮化合物的分解代谢，降低血清尿素氮的形成，提高肝糖原和肌糖原贮备能力，明显延长小鼠游泳运动的耐力时间，起到抗疲劳作用。周志刚等 7报道，极大螺旋藻多糖抗衰老的机制主要是对于体内 OH自由基具有很强的抗氧化作用。螺旋藻在以上方面的研究和应用使得这一优质资源受到了国内外研究人员越来越广泛的关注。1.2 植物体内抑菌成分的研究据研究，植物中具有抑菌活性的有效成分结构类型有很多，例如生物碱类、黄酮类、挥发油等，基本涉及到了植物的各种成分 8。在同一种植物中可能有不同或者相同的抑菌成分发挥着作用，在不同植物中，也可以含有不同或者相同的物质对微生物有抑制作用，即具有广泛的抑菌能力 9。近几年来，许多专家学者也在植物的许多种类如石榴、蒲公英、艾蒿、苍耳、乌梅、香菜等方面做了抑菌性的研究，都表明植物源抑菌、杀菌剂在化学农药泛滥的今天有很大的研发价值。1.3 藻类植物抑菌活性的研究目前对于藻类植物抑菌性研究主要集中在巨型海藻中 10，关于微藻抑菌活性的研究却比较少 11、12 ，在蔡瑾 13关于钝节拟丽藻的研究中表明钝节拟丽藻的晋中学院生物科学与技术学院 2015 届毕业论文（设计）1抑菌效果较好，提取的办法简单易行，能够做为一种新的微藻类植物源杀菌剂开发利用。也有少量报道称螺旋藻的石油醚、乙醇、乙烷、乙酸乙脂等提取物及分离得到的物质能够有效地抑制细菌、霉菌等生长，如杜玲 14采用管碟法研究了钝顶螺旋藻多糖的体外抗菌活性，研究表明 2040mgmL -1 螺旋藻浓度对痢疾杆菌、假单孢绿脓杆菌和变形杆菌均有一定的抑制作用。1.4 藻类植物活性成分的提取分离和鉴定1.4.1 藻类植物活性成分的提取关于藻类等植物活性成分的提取有很多方法，传统方法中最常见的是采用水蒸气蒸馏法和溶剂提取法 15，而溶剂提取法又包括有浸提法和回流法。伴随着现代科技进步而发展起来的一些新的提取方法有破碎提取法、超声波提取法、微波提取法和超临界萃取法等。与传统的提取方法相比现代化的提取方法在提取效率和纯度方面都有了很大的提升。1.4.2 藻类植物活性成分的分离鉴定藻类植物有效成分的分离方法主要有膜分离法、柱色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、萃取法等。成分鉴定的方法有质谱法（MS）、红外光谱法（IR）、紫外-可见光谱法（UV/Vis）法，而近几年来，质谱通过与其他方法的连用如气象色谱的连用使得应用范围进一步扩大，气相色谱-质谱联用（GC-MS）已经成为鉴定有效成分结构中的最佳方法之一 13。1.5 本课题研究的目的及内容1.5.1 研究目的和意义本论文的研究，主要建立螺旋藻抑菌活性成分分离、鉴定模式；明确其主要抑菌活性成分及结构；对主要成分进行抑菌作用比较。这些研究对螺旋藻在医药、食品等领域中抑菌、抗菌方面应用可提供科学的理论依据，同时对螺旋藻类资源的进一步开发利用开辟新路。1.5.2 研究内容(1)采用不同极性的有机溶剂即无水乙醇，乙酸乙酯，石油醚对螺旋活性成分进行萃取分离；(2)对各溶剂提取部位针对大肠杆菌进行抑菌活性研究；(3)根据抑菌结果，对抑菌作用强的活性部位进行分离纯化；晋中学院生物科学与技术学院 2015 届毕业论文（设计）2(4)对活性物质进行结构分析、鉴定。2 材料与方法2.1 试验材料与仪器2.1.1 试验原料干燥螺旋藻粉末2.1.2 供试菌种供试细菌：大肠杆菌（Escherichia coli）供试菌种由山西大学生命科学学院微生物学实验室提供。2.1.3 培养基 16（1）牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏 3.0g、蛋白胨 10.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水 1000mL、加热融化，调节 pH 值为 7.4-7.6,分装，高压湿热灭菌（121、20min），-4冷藏备用。（2）牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏 3.0g、蛋白胨 10.0g、琼脂粉 15-20g、氯化钠 5.0g、蒸馏水 1000mL、加热融化，调节 pH 值为 7.4-7.6,分装，高压湿热灭菌（121、20min），-4冷藏备用。2.1.4 试验试剂及药品所需试剂药品见表 1。表 1 试剂及药品名称 规格 生产厂家牛肉膏 BR 北京奥博星生物技术有限责任公司蛋白胨 BR 北京奥博星生物技术有限责任公司 Agar - Japan氯化钠 AR 天津市光复科技发展有限公司氢氧化钠 AR 天津市进丰化工有限公司无水乙醇 AR 天津市进丰化工有限公司乙酸乙酯 AR 天津市风船化学试剂科技有限公司30-60 石油醚 AR 天津市光复科技发展有限公司 晋中学院生物科学与技术学院 2015 届毕业论文（设计）32.1.5 主要仪器设备试验仪器与设备见表 2。表 2 仪器与设备名称 规格 生产厂家超净工作台 SN-CJ-1FD 上海博迅有限公司医疗设备厂恒温水浴锅 DFD-700 天津市泰斯特仪器有限公司数显鼓风干燥箱 GZX-9070MBE 上海博迅有限公司医疗设备厂电热恒温培养箱 DH4000II 天津市泰斯特仪器有限公司立式压力蒸汽灭菌器 YXQ-LS-50S11 上海博迅有限公司医疗设备厂循环水式多用真空泵 SHZ-III 上海知信实验仪器技术有限公司旋转蒸发仪 RE-52C 上海亚荣生化仪器厂气质联用仪 Agilent5975-6890 美国安捷伦公司电子天平 TB-214 微量进样器索氏提取器2.2 试验方法2.2.1 螺旋藻不同极性溶剂提取物的制备精确称取三份 20g 干燥螺旋藻粉末，分别以无水乙醇，乙酸乙酯，石油醚为溶剂按照 1:10 的液料比加入圆底烧瓶中，浸提温度分别保持在 75，70，25回流浸提 6h。浸提结束后取浸液经真空泵抽滤得到滤液，再经旋转蒸发仪将其浓缩至 5mL,4密封冷藏备用。2.2.2 螺旋藻不同极性溶剂提取物的抑菌活性试验2.2.2.1 供试菌株的制备将大肠杆菌菌种移入已灭菌的试管斜面培养基上，接种多支做重复。置于37恒温培养箱中培养 24h 进行活化，其余冷藏备用。2.2.2.2 菌悬液的制备取出培养 24h 后的大肠杆菌斜面培养基于超净工作台加 5mL 无菌水洗脱，晋中学院生物科学与技术学院 2015 届毕业论文（设计）4将洗脱液转移至 1000mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养 24h，经平板检验制成 106-108CFUmL-1 的菌悬液待用。每毫升中菌落形成单位（CFU）=同一稀释度重复的平均菌落数稀释倍数52.2.2.3 抑菌液的制备（1）原液定义：1mL 提取液含有相当于 1g 生药量（1gmL -1） 17。（2）将 2.2.1 中浓缩至 5mL 的抑菌液用相应的提取溶剂稀释至 10mL,制成浓度为 2gmL-1 的螺旋藻抑菌液。取样试验后用同样方法倍比稀释制成 1gmL-1,0.5gmL-1 的螺旋藻抑菌液。（3）螺旋藻抑菌液编号表 3 螺旋藻抑菌液编号不同极性溶剂提取螺旋藻抑菌液 编号A(2gmL-1)无水乙醇提取液 AI(1gmL-1)AII(0.5gmL-1)B(2gmL-1)乙酸乙酯提取液 BI(1gmL-1)BII(0.5gmL-1) C(2gmL-1) 石油醚提取液 CI(1gmL-1)CII(0.5gmL-1)2.2.2.4 螺旋藻不同溶剂提取物抑菌活性研究将制备好的菌悬液与牛肉膏蛋白胨液体培养基以 1:3 比例加入锥形瓶中，37环境下培养 24h 后分别加入 2gmL-1 抑菌液，1gmL -1 抑菌液以及 0.5gmL-1抑菌液 2ml，对照组分别加入不同极性溶剂和无菌水，重复两次，培养 24h。取锥形瓶中试验样品梯度稀释至 10-4，用移液枪取 0.1mL 于制备好的平板并用涂布棒涂匀，静置 10min，贴好标签，平行两次，在 37的环境下倒置培养24h。观察菌落个数并计数。晋中学院生物科学与技术学院 2015 届毕业论文（设计）5抑菌率=（对照实验菌落数-相应浓度提取液实验菌落数）/对照实验菌落数100。2.2.3 螺旋藻抑菌活性成分分离鉴定取抑菌效果最好的螺旋藻极性溶剂提取物利用气相色谱-质谱连用的技术18-20鉴定抑菌活性成分。石英毛细管柱（DB-624）：60m0.25mm1.40m；载气：高纯He（99.999%）； 流速：1mL/min；进样模式：不分流进样；节省气：20.0 mL/min；进样口温度： 250；程序升温：初温 40保持 1 min，以 8/min 升温至 220，保持 2 min， 再以 4/min 升温至 250，保持 20 min；GC-MS 接口温度：280；EI 离子源，电离能量： 70eV；离子源温度： 230，四极杆温度：150；质量扫描范围：30 amu-500amu。检索谱库：NIST08.L。3 结果与分析3.1 螺旋藻不同极性溶剂提取物的抑菌效果3.1.1 螺旋藻无水乙醇提取物的抑菌作用表 4 螺旋藻无水乙醇提取物对大肠杆菌的抑菌作用抑菌液 菌落平均数 抑菌率A 282 9.5263 15.6AI 301 3.4297 4.7AII 421 -402 -无水乙醇 331292注 ：-表示无效数据晋中学院生物科学与技术学院 2015 届毕业论文（设计）6图 1 A 抑菌液对大肠杆菌的作用 图 2 AI 抑菌液对大肠杆菌的作用图 3 AII 抑菌液对大肠杆菌的作用 图 4 无水乙醇对大肠杆菌的作用 从表 4 中的数据及图 1-4 可以看出，无水乙醇与螺旋藻无水乙醇提取物相比较，螺旋藻无水乙醇提取物的抑菌效果要好于无水乙醇，而通过进一步的比较 AI， AII，AIII 对大肠杆菌的抑菌作用可发现它们之间的抑菌效果为AI AIIAIII。晋中学院生物科学与技术学院 2015 届毕业论文（设计）73.1.2 螺旋藻乙酸乙酯提取物的抑菌作用表 5 螺旋藻乙酸乙酯提取物对大肠杆菌的抑菌作用抑菌液 菌落平均数 抑菌率B 75 79.363 82.6BI 68 81.262 82.9BII - -96 73.5乙酸乙酯 396330注 ：-表示无效数据图 5 B 抑菌液对大肠杆菌的作用 图 6 BI 抑菌液对大肠杆菌的作用图 7 BII 抑菌液对大肠杆菌的作用 图 8 乙酸乙酯对大肠杆菌的作用晋中学院生物科学与技术学院 2015 届毕业论文（设计）8从表 5 中的数据及图 5-8 可以看出,螺旋藻乙酸乙酯提取物对大肠杆菌的抑菌效果远大于乙酸乙酯，且发现 BI，BII 之间的抑菌效果基本无差别，均比BIII 效果明显。3.1.3 螺旋藻石油醚提取物的抑菌作用表 6 螺旋藻石油醚提取物对大肠杆菌的抑菌作用抑菌液 菌落平均数 抑菌率C 378 6.7396 2.2CI 379 6.4- -CII 392 3.2398 -石油醚 410400注 ：-表示无效数据图 9 C 抑菌液对大肠杆菌的作用 图 10 CI 抑菌液对大肠杆菌的作用晋中学院生物科学与技术学院 2015 届毕业论文（设计）9图 11 CII 抑菌液对大肠杆菌的作用 图 22 石油醚对大肠杆菌的作用从表 6 中的数据及图 9-12 可以看出，螺旋藻石油醚提取物对大肠杆菌有一定的抑制作用，C，C I，CII 之间抑菌作用的关系为 CCICII。由表 4-6，图 1-12 的抑菌作用结果进行分析可知，在乙醇，乙酸乙酯，石油醚之间，乙醇的抑菌效果要显著好于乙酸乙酯和石油醚，而通过比较其提取螺旋藻产物对大肠杆菌的抑菌效果时，发现乙酸乙酯提取物对大肠杆菌的抑制效果明显优于乙醇和石油醚的提取物