金黄色葡萄球菌耐药性PPT课件

金黄色葡萄球菌耐药性,生命科学学院2014级生物技术（产业计划）,金黄色葡萄球菌,1.金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8m左右，显微镜下排列成葡萄串状,无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37，最适生长pH 7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径12mm。2.血平板菌落周围形成透明的溶血环。有高度的耐盐性，可在1015% NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。3.具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。4.甘露醇高盐琼脂可用于金黄色葡萄球菌的选择性分离培养。有致病性、引发化脓局部或全身感染。,青霉素,抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素。种类多，有天然、半合成等。细菌细胞壁具有保护和维持细菌正常形态的功能，主要成分为胞壁黏肽(mucopeptide,也称肽聚糖，peptidoglycan)，是由两股改变氨基糖的线性多糖链(N-乙酰葡萄糖胺，N-acetylglucosamine, GNAC；N-乙酰胞壁酸，N-acetylmuranic acid, MNAC)通过肽链交联而成。1革兰阳性细菌细胞壁有50-100个分子厚，而革兰阴性细菌仅1-2个分子厚。其生物合成可分为3个阶段：胞质内黏肽前体的形成；胞质膜上为乙酰胞壁五肽与乙酰葡萄糖胺连接；在细胞膜外，通过转肽作用完成交叉连接过程。青霉素含有高活性-内酰胺环，与连接MNAC的五肽的最后二肽（即D-丙氨酰-D-丙氨酸）结构相似，转肽酶与-内酰胺环的酰胺键共价结合，形成乙酰化转化酶，使转肽作用不能进行，交叉联结受阻，致细胞壁缺损，而失去保护屏障。由于菌体内渗透压高，在等渗环境中水分不断渗入，致细胞肿胀、变形，在自溶酶激活影响下，细菌破裂溶解而死亡。,PBP（青霉素结合蛋白）,-内酰胺类抗生素的-内酰胺环与细菌D-丙氨酰-D-丙氨酸末端有相似结构，能与D-丙氨酰-D-丙氨酸竞争PBP的活性位点，且比D-丙氨酰-D-丙氨酸与PBP的亲和性更高，它通过-内酰胺环的羧基和细菌相应的PBP中的丝氨酸羟基共价结合形成丝氨酸脂，干扰PBP的正常酶活性，从而干扰肽聚糖的合成，使细胞壁合成受阻，最终导致细菌死亡。,它具有糖基转移酶、肽基转移酶和羧肽酶活性，能够催化肽聚糖聚合和交联，参与细菌肽聚糖生物合成的末端反应、形态维持及调整等功能，在细菌生长繁殖过程中起重要作用。,青霉素酶,1.催化水解青霉素-内酰环产生青霉噻唑酸的一类-内酰胺酶2.使青霉素类抗生素水解失活；3.筛选标记（青霉素抗性基因）；4.次生菌落；,细菌耐青霉素,1.产生青霉素酶（-内酰胺酶）青霉素失效细胞壁正常合成2.PBP改变与青霉素类抗生素的亲和力下降不能被乙酰化失活可以催化转肽反应细胞壁正常合成3.细胞壁或外膜通透性改变青霉素难以进入抑菌杀菌作用弱4.缺少自溶酶天然的抵制青霉素,金黄色葡萄球菌耐青霉素,1.获得产青霉素酶的功能,2.PBP的改变(1)PBP含量会发生变化；(2)PBP与-内酰胺类抗生素的亲和力降低，缓慢结合的PBP；(3)产生不依赖-内酰胺酶存在而对-内酰胺类抗生素耐药的诱导性PBP。,青霉素酶的检测,1.金黄色葡萄球菌的选择性培养甘露醇高盐琼脂（PBP改变验证同操作）2.制备菌悬液3.青霉素酚红纸片制备4.检测,PBP的改变,1.金黄色葡萄球菌有5种PBP，即PBP1、PBP2、PBP3、PBP4以及PBP2b。2.高度耐药性是由于原有的PBP2与PBP3之间产生一种新的PBP2a，低、中度耐药性是由于PBP的产量增多或青霉素的亲和力下降所致。3.在无抗生素存在情况下，PBP2和PBP4的转肽酶共同参与细胞壁的合成，PBP2的转肽酶负责合成二聚、三聚、四聚肽聚糖，PBP4的转肽酶负责将他们进行交联，最终形成高度交联的肽聚糖。在-内酰胺类抗生素存在的情况下，抗生素会抑制PBP2的转肽酶活性，而mecA基因编码的PBP2a与青霉素结合能力较差，不受影响，其转肽酶可代替PBP2的转肽酶行使功能，合成肽聚糖，维持耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的正常繁殖，从而使细胞产生了耐药性。,mecA基因的表达调控,mecA（PBP2a）的表达主要受其调控系统mecR1和mecI控制。在没有抗生素存在的情况下，由mecI编码的抑制子结合到mecA的启动子区，阻止mecA的转录和翻译，因此在正常情况下PBP2a的表达量很低；在-内酰胺类抗生素的压力下，mecR1在跨膜信号的刺激下，自身活化，活化的mecR1具有金属蛋白酶的作用，从而对结合在mecA启动子区的MecI抑制子发挥剪切作用，使MecI失活，而促进mecA的表达感菌株转变为耐药菌株可以通过MecI的失活或丢失，以及mecA操纵子区发生突变等机制实现。,因PBP改变而产生耐药性法一：对发酵液中的金黄色葡萄球菌纯培养物做耐药性表型鉴定，与PBP改变相应数据比较。（菌落形态、生理生化特征、遗传特征）法二：从金黄色葡萄球菌的mecA基因出发检测PBP2a的表达量抗原抗体杂交mecA转录产物丰度测定荧光定量PCR或放射探针分子水平的操作（试剂盒）高效、灵敏补救防止倒罐：1.青霉素类抗生素联合使用：青霉素、万古霉素等；2.若发酵采用的为革兰氏阴性菌株，可以添加适量的溶菌酶；,参考VP反应：微生物检验中常用的生化反应之一。某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP（+）反应。甲基红实验（MR反应）：根据肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红这个原理进行的测验。文献：李冀, 杨慧, 呼延霆,等. 细菌青霉素结