PCR扩增的原理和操作步骤

汇总pcr 扩增的原理和操作步骤PCR 扩增反应的操作第一节 PCR 扩增反应的基本原理 一、聚合酶链式反应(PCR)的基本构成 PCR 是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板(克隆或基因组 DNA)的扩增反应，是模拟体内 DNA 复制过程，在体外特异性扩增 DNA 片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于 DNA 作图、DNA 测序、分子系统遗传学等。PCR 基本原理: 是以单链 DNA 为模板，4 种 dNTP 为底物，在模板 3末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板 DNA 得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的 DNA 片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的2+DNA 膜板、四种 dNTP 溶液、耐热 Taq DNA 聚合酶、Mg 等。反应时先将上述溶液加热，使模板 DNA 在高温下变性，双链解开为单链状态;然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火;再将温度升至合适温度，在 Taq DNA 聚合酶的催化下，以 dNTP 为原料，引物沿 5?3方向延伸，形成新的 DNA 片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此 PCR 循环过程为三部分构成:模板变性、引物退火、热稳定 DNA 聚合酶在适当温度下催化 DNA 链延伸合成(见图)。 1(模板 DNA 的变性 模板 DNA 加热到 9095?时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA 的变G-C 间由三个性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与 DNA 中G-C 含量有关，氢键连接，而 A-T 间只有两个氢键相连，所以 G-C 含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故 PCR 中 DNA 变性需要的温度和时间与模板 DNA 的二级结构的复杂性、G-C 含量高低等均有关。对于高 G-C 含量的模板 DNA 在实验中需添加一定量二甲基亚砜(DMSO)，并且在 PCR 循环中起始阶段热变性温度可以采用 97?，时间适当延长，即所谓的热启动。 2(模板 DNA 与引物的退火 将反应混合物温度降低至 3765?时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成 DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板 DNA 的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为 1,2min。 3(引物的延伸 DNA 模板-引物复合物在 Taq DNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板 DNA 链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板 DNA 的长度。在 72?条件下，Taq DNA 聚合酶催化的合成速度大约为 40,60 个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的 DNA 都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA 拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2,4min，一次 PCR 经过 30,40 次循环，约 2,3h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶 DNA 产物的浓度不再增加。 PCR 的三个反应步骤反复进行，使 DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的 DNA 扩增量可用 Yn,(1，X)计算。Y 代表 DNA 片段扩增后的拷贝数，X 表示平(Y)均每次的扩增效率，n 代表循环次数。平均扩增效率的理论值为 100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列 DNA 片段的增加呈指数形式，随着 PCR 产物的逐渐积累，被扩增的 DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及 DNA 聚合酶 PCR 的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 PCR 扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链 5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的 DNA 为模板，引物是从 3端开始延伸，其 5端是固定的，3端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的 5端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段 3端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得 PCR 的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯 DNA 片段供分析与检测用。变性 退火 延伸 图 PCR 的反应历程 二、PCR 反应的五个元素 2+参与 PCR 反应的物质主要为五种:引物、酶、dNTP、模板和 Mg。 1(引物 引物是 PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。引物设计有 3 条基本原则:首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应(即错配)。 引物的选择将决定 PCR 产物的大小、位置、以及扩增区域的 Tm 值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在 RNA-PCR 中也能识别 cDNA 或基因组模板。引物设计也极大的影响扩增产量:若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有;而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。当然，即使有了 2+好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整 Mg 浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保 PCR 的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。 (1)引物长度 PCR 特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。引物的长度一般为 15-30bp，常用的是 18,27bp，但不应大于 38bp。引物过短时会造成 Tm 值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对;?，不适引物过长时又会造成 Tm 值过高，超过酶反应的最适温度，还会导致其延伸温度大于 74 于 Taq DNA 聚合酶进行反应，而且合成长引物还会大大增加合成费用。 (2)引物碱基构成 引物的 G+C 含量以 40,60%为宜，过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC 含量不能相差太大。其 Tm 值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于 Tm 值 5,10?。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的 Tm 值，则有效引物的 Tm 为 55,80?，其 Tm 值最好接近 72?以使复性条件最佳。引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3端不应超过 3 个连续的 G 或 C，因这样会使引物在 G+C 富集序列区错误引发。 (3)引物二级结构 引物二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的 3末端形成的二聚体，应控制其 G 大于-5.0 kcal/mol 或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或 5端的要求可适当放宽。引物自身形成的发卡结构，也以 3端或近 3端对引物-模板结合影响更大;影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大的关系。应尽量避免 3末端有发卡结构的引物。 (4)引物 3端序列 引物 3末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3末端最后 5 到 6 个核苷酸的错配应尽可能的少。如果 3末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。 引物 3末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。应特别注意引物不能互补，尤其是在 3末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的 PCR 产物其实是引物自身的扩增。这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争 PCR 状态，从而影响扩增成功。引物 3末端的稳定性由引物 3末端的碱基组成决定，一般考虑末端 5 个碱基的 G。?G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，此值的大小对扩增有较大的影响。应当选用 3端?G 值较低(绝对值不超过 9)，负值大，则 3末端稳定性高，扩增效率更高。引物的 3端的?G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应。需要注意的是，如扩增编码区域，引物 3端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。另外末位碱基为 A 的错配效率明显高于其他 3 个碱基，因此应当避免在引物的 3端使用碱基 A。 (5)引物的 5端 引物的 5端限定着 PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响3+扩增的特异性。引物 5端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu 等;引入蛋白质结合 DNA 序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。对于引入一至两个酶切位点，应在后续方案设计完毕后确定，便于后期的克隆实验，特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中。 (6)引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 70%或有连续 8 个互补碱基同源，特别是与待扩增的模板 DNA 之间要没有明显的相似序列。 2(酶及其浓度 Taq DNA 多聚酶是耐热 DNA 聚合酶，是从水生栖热菌(Thermus aquaticus)中分离的。Taq DNA 聚合酶是一个单亚基，分子量为 94 000 Da。具有 53 的聚合酶活力，53的外切核酸酶活力，无 35的外切核酸酶活力，会在 3末端不依赖模板加入 1 个脱氧核苷酸(通常为 A，故 PCR 产-5-4 物克隆中有与之匹配的 T 载体)，在体外实验中，Taq DNA 聚合酶的出错率为 10,10。此酶的发现使PCR 广泛的被应用。 此酶具有以下特点: (1)耐高温，在 70?下反应 2 小时后其残留活性在 90%以上，在 93?下反应 2 小时后其残留活性是仍能保持 60%，而在 95?下反应 2 小时后为原来的 40%。 (2)在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。(3)一般扩增的 PCR 产物长度可达 2.0 kb，且特异性也较高。 PCR 的广泛应用得益于此酶，目前各试剂公司中开发了多种类型的 Taq 酶，有用于长片段扩增的酶，扩增长度极端可达 40kb;有在常温条件下即可应用的常温PCR 聚合酶;还有针对不同实验对象的酶等。 一典型的 PCR 反应约需的酶量为 2.5u(总反应体积为 50,l 时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 3(dNTP 的质量与浓度 dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH或 1M Tris。HCl 的缓冲液将其 pH 调节到 7.0,7.5，小量分装，-20?冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。在 PCR 反应中，dNTP 应为 50,200,mol/l，尤其是注意 4种 dNTP 的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。dNTP2+2+能与 Mg 结合，使游离的 Mg 浓度降低。 4(模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是 PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。SDS 的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶 K 能水解消化蛋白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂(酚与氯仿抽)抽提除去蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸，该核酸即可作为模板用于 PCR 反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于 PCR 扩增。 模板 DNA 投入量对于细菌基因组 DNA 一般在 110ng/,l，实验中模板浓度常常需要优化，一般可选择几个浓度梯度(浓度差以 10 倍为一个梯度)。在 PCR 反应中，过高的模板投入量往往会导致 PCR 实验的失败。 2+5(Mg 浓度 2+Mg 对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR 反应中，各种dNTP 浓度为2+2+200,mol/l 时，Mg 浓度为 1.5,2.0mmol/l 为宜。Mg 浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。一般厂商提供的 Taq DNA 聚合酶2+2+均有相应的缓冲液，而 Mg 也已添加，如果特殊实验应采用无 Mg 的缓冲液，在 PCR 反应体系2+中添加一定量的 Mg。 三、PCR 反应特点 PCR 反应具有以下特点: 1(强特异性 PCR 反应的特异性决定因素为:(1)引物与模板 DNA 特异性的结合;(2)碱基配对原则;)Taq DNA 聚合酶合成反应的忠实性;(4)靶基因的特异性与保守性。 (3其中引物与模板的正确结合是关键，引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及 Taq DNA 聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的