第三章 生物制品的制备 生物制品学 教学课件

l第三章 生物制品的制备l Preparation of biopreparate第一节 一般生物制品的制备方法 (Preparation of general bio-preparate )l 一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法 （ Selection、 pretreatment and preservation of raw material of biopreparate） l （ 1）原料选择l 原料的选择原则 ：l 有效成分含量高，新鲜；l 原料来源丰富，产地较近；l 原料中杂质含量少；l 原料成本低等。原料的选择注意事项： 植物原料生长的季节性； 微生物原料的对数期； 动物原料的年龄与性别。（ 2）原料的预处理与保存： 动物原料 ：采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。 植物原料 ：要择时采集并就地去除无用的部分，保鲜处理； 微生物原料 ：要及时将菌体细胞与培养液分开，进行保鲜处理。 原料的保存方法主要有：l 冷冻法 。该方法适用于所有生物原料。常用 -40 速冻。l 有机溶剂脱水法 。常用的有机溶剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。l 防腐剂保鲜 。常用乙醇、苯酚等。该法适用于液体原料，如发酵液、提取液等。 l 二、生物制品的提取（ extraction）l (1)生物组织与细胞的破碎 （ smash of tissue and cell）：生物制品大部分存在于生物组织或细胞中，要提高提取率，破碎过程是非常重要的。常用的破碎方法： l 磨切法 ，该法属于机械破碎方法，设备有组织捣碎机、胶体磨、匀浆器、匀质机、球磨机、乳钵等。l 压力法 ，有 加压与减压 两种，常用的法兰西压釜、细菌压等使用效果良好。l 反复冻融 (freeze thawing)法 ，设备简便，活性保持好，但用时较长。l 超声波振荡破碎 (ultrasonic oscillation crash)法 ，该方法破碎效果较好，但由于局部发热，对活性有损失。l 自溶法 (autolyze method)或酶解法(enzymolysis method)，用得较少。l （ 2）提取（ extraction）l 生物组织与细胞破碎后要立即进行提取。提取时，首先要根据活性物质的性质，l 选择提取试剂 。提取试剂主要有：水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂（如氯仿、丙酮等）。l 考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取时间。l 注意提取的温度、 pH、变性剂等因素。 三、蛋白质类制品的分离纯化方法（Separation and depuration of protein production） 包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有： (1)沉淀法 （ precipitation）： 蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。 原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质 。常用的有盐析法（ salting out）、 有机溶剂沉淀法（ organic solvent precipitation）、 等电点沉淀法（ isoelectric precipitation）、 与靶物质结合沉淀法（如抗体 抗原）（ target banding precipitation） 等。 (2) 按分子大小分离的方法： 有 超滤法 （ultrafiltration） 和 透析法 （ dialysis）（ 即膜分离方法）、 凝胶层析法 （ gel chromatography）、 超速离心法 （ ultra centrifugation） 等。其中膜分离法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和脱盐。 (3)按分子所带电荷进行分离的方法氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解质。它们具有 等电点 (pI)， 在离开等电点的 pH时便会带正或负电荷。例如某蛋白质等电点为 7.0，当溶液 pH为4.0时，分子则带有正电荷。由于具有该性质，利用带电性质进行分离是极其有效的方法。利用电学性质进行分离的方法有 离子交换柱层析法 （ ion-exchange chromatography）、 电泳法 （electrophoresis）、 等电聚焦法 （ isoelectric focusing） 等。（ 4）亲和层析法（ affinity chromatography）大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶与底物 (Substrate)（ 或抑制剂 (inhabitor)）、 抗原与抗体、激素 (hormone)与受体 (receptor)等，它们之间有特异的亲合作用， 利用该性质设计的特异层析分离技术称为亲和层析。亲和层析分离专一性强，操作简便，是当前应用很广泛的分离方法之一。另外，最近出现的新方法还有 疏水层析 （hydrophobic chromatography） 等。 四、核酸类制品的分离纯化方法（ Separation and purification of nucleic acid ）核酸类药物生产方法主要有 提取法和发酵法 。提取法 生产 DNA和 RNA， 先提取核酸和蛋白质复合物，再解离核酸与蛋白质，然后分离 RNA与DNA。 发酵法 主要用于生产 单核苷酸。 0五、糖类制品的分离纯化方法（ Separation and purification of glucide ）由于各种糖类制品的性质和原料来源不同，没有统一规范的提取和纯化工艺。这里只介绍 多糖和粘多糖 的一般分离纯化方法。 （ 1）提取方法 （ extraction）非降解法 (nondegradation)适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖，提取采用的溶剂是水或盐溶液。降解法 （ degradation） 适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖（ mucoitin）。 如从软骨中分离提取硫酸软骨素（ chondroitin sulfate）， 就是用 碱处理 进行降解。又如用 酶处理 法可提取与蛋白质结合的多糖。（ 2）分离方法 （ Separation）常用的分离方法是沉淀法和离子交换层析法。 乙醇沉淀法 （ alcohol precipitation） ：是从提取液中沉淀多糖的最简易方法，也适用于分级分离 。 4-5倍体积的乙醇可以使任何结缔组织中的粘多糖完全沉淀。用 季铵化合物 也可沉淀粘多糖。粘多糖的聚阴离子能 与某些阳离子表面活性剂结合 成不溶于水的盐，如十六烷基三甲基铵（ CTA） 等。 离子交换层析法 （ ion exchange chromatagraphy)： 粘多糖的聚阴离子能够很好地被阴离子交换剂吸附和分离，如Dowex I-X2（ 商品名）离子交换树脂、DEAE-离子交换纤维素（二乙胺乙基）等。洗脱可用 NaC1溶液进行梯度洗脱。六、脂类制品的分离纯化方法 （ Separation and purification of lipid）（ 1）提取方法（ extraction ）脂类自然状态下是以结合形式存在的。非极性脂是与其他脂质分子或蛋白质分子的疏水区相结合的。 提取脂质就是要选择适当的溶剂来破坏这种结合键，将脂质溶解出来。 常用的溶剂有组合溶剂，醇是其中的主要成分，此外还有氯仿、甲醇、水等。 （ 2）纯化方法（ purification） 沉 淀 法 (precipitation) ： 由于不同脂质在丙酮中溶解度不同，故常用它进行沉淀。吸附层析法 (adsorption chromatography)：常用吸附剂有硅胶、氧化铝等 。它是通过极性和离子力等把各种化合物结合到固体吸附剂上。 洗脱 一般是采用极性逐渐增大的洗脱液来进行，非极性的先流出，极性的后流出 。 离子交换层析法 (Ion exchange chromatography) : 脂质分子的存在有非解离、两性离子和酸式解离三种状态 。根据它们在一定 pH条件下的解离情况，选择适当的离子交换剂 可将它们提纯。如 TEAE 纤维素(Triethylaminoethyl cellulose)对分离脂肪酸和胆汁酸等特别有效。 l 七、氨基酸类制品的分离纯化方法 l （ Separation and purification of Aa）l （ 1）氨基酸的生产方法 (production of Aa)l 蛋白质水解法 (protein hydrolysis)：水解法 有酸水解 (acid hydrolysis )、碱水解 (base hydrolysis)和酶水解(enzyme hydrolysis)三种 。l 用 盐酸水解 (HCl hydrolysis)为常用方法，其 优点 是水解迅速、完全，产物全部是 L 型氨基酸， 缺点 是色氨酸全部被破坏，丝氨酸等部分被破坏。l 碱水解法 (alkali hydrolysis)易产生消旋作用，较少应用。l 酶水解法 (enzyme hydrolysis)水解不够完全。 发酵法 (fermentation)：菌株经过发酵后，从培养液中提纯氨基酸。 化学合成 (chemosynthesis)与酶促合成法 (enzyme catalyzed synthesis)化学合成法 一般得到的是 DL 型氨基酸，尚需要对异构体拆分； 酶促合成法 也是酶工程在医药工业上的应用， 优点 是技术工艺简单，转化率高，副产物少和易提纯等。l （ 2）氨基酸的分离方法 (Separation of Aa )有 沉淀法 (precipitation) 、吸附法(adsorption)和离子交换法（ ion-exchange ) 。沉淀法 (precipitation)：根据形成沉淀的原理不同分为两种： 是依据不同氨基酸在水中或其他溶剂中的溶解度差异进行沉淀分离。 是用特殊试剂沉淀某种氨基酸， 如用邻二甲苯 -4-磺酸与亮氨酸形成不溶性盐沉淀，再用氨水分解，使亮氨酸游离出来 。吸附法 (adsorption)：这是利用 吸附剂根据氨基酸吸附力的差异 进行氨基酸分离的方法。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分离就是利用活性炭对其吸附的原理。离子交换法 （ ion-exchange )：氨基酸是两性电解质，在一定 pH条件下， 不同氨基酸带电性质及解离状态是不相同的 ，因此在离子交换剂上被吸附的强度不同 。常用的 离子交换剂 为强酸型阳离子交换树脂， 洗脱 主要用 pH梯度洗脱。 第二节 人体来源生物制品制备实例 （ Example of bio-preparate application to human）一、人血浆白蛋白制剂的制备 （ preparate of human blood plasma albumin ）血（无抗凝剂） 自然凝固 分离出血清（无纤维蛋白酶原、凝血因子等）血 +混合抗凝剂 草酸铵草酸钾 离 心 上清血浆总蛋白： 6.2-7.9%白蛋白： 3.8-4.8%水： 90-92%（现常用肝素、柠檬酸钠）（ 1） 结构和性质 （ structure and character）白蛋白（ albumin） 又称人血浆白蛋白，约占血浆总蛋白的 65%。是维持血浆胶体渗透压的主要物质。白蛋白为单链分子 pI为 4.7， 易溶于水 ，在 60%硫酸铵饱和度以上沉淀。 对酸较稳定，受热变性 。从人体中分离的白蛋白有两种： 人血浆白蛋白和胎盘白蛋白。 （ 2）工艺路线（图 3-1）2% 利凡诺、 NaHCO3pH8.6,离心分离