植物细胞微核检测技术ppt课件

实验 四 植物 细 胞微核技 术检测一、 实验 目的 1、了解 细 胞微核形成的机理及其形 态 特点； 2、学 习 植物根尖 细 胞的微核 检测 技 术 。二、 实验 原理 微核 (micronucleus)简 称 MCN，是真核 类 生物 细 胞中的一种异常 结 构，往往是 细 胞 经辐 射或化学 药 物的作用而 产生的。在 细 胞 间 期，微核呈 圆 形或 椭圆 形，游离于主核之外，大小 应 在主核 1/3以下。微核的折光率及 细 胞化学反 应 性 质 和主核一 样 ，也具合成 DNA的能力。 一般 认为 微核是由有 丝 分裂后期 丧 失着 丝 粒的染色体断片 产 生的，在有 丝 分裂后期不能向两极移 动 ，所以游离于 细 胞 质 中，在 间 期 细 胞核形成 时 ，即可在它附近看到一到几个很小的 圆 形 结 构，直径大 约 是 细 胞直径的 1/201/5， 这 就是微核。 微核率的大小是和用 药 的 剂 量或 辐 射累 积 效 应 呈正相关 ，因此，微核是常用的 遗传 毒理学指 标 之一，指示染色体或 纺锤 体的 损伤 。微核 测试 已用于 辐 射损伤 、 辐 射防 护 、化学 诱变剂 、新 药试验 、染色体遗传 疾病及癌症前期 诊 断等各方面。 三、 实验 材料：大蒜、大豆、蚕豆等。四、 实验仪 器 设备：显 微 镜 、恒温培养箱、恒温水浴 锅 、 镊 子、载 玻片及盖玻片。五、 实验 步 骤 ：1、浸种催芽：将 实验 用的蚕豆按所需要量放入盛有自来水的 烧 杯中，浸泡 24h，此 间 至少 换 水两次。种子吸 涨 后， 经 3648h，大部分初生根 长 至12cm。2、 处 理根尖：阳性 检测 采用 1.02.5M CrO3， 0.51.5M NaN3， 150250mM EMS， 对 照用自来水处 理， 处 理 时间 24h。3、恢复培养： 处 理后的根尖用自来水浸洗 3次，每次 2-3min，洗 净 后在水中恢复培养 24h。4、固定：用甲 醛 ：冰醋酸（ 3： 1）固定液固定 24h后弃去固定液，或 换 入 70酒精中保存。5、酸解：弃去固定液，用清水漂洗 2-3次，吸 净 水，加入6M盐 酸，于室温解离 10min，弃去 盐 酸，漂洗根尖 2-3次， 彻 底洗 净盐 酸。6、染色：截下 1-2mm长 的根尖，滴加石炭酸品 红 染液，染色 10min，加盖玻片， 压 片 观 察。 固定 是借助于物理方法或化学 药剂 的作用，迅速透入 组织 和 细 胞将之 杀 死，并且使其 结 构和内含物如：蛋白 质 ，脂肪，糖 类 以及核物 质 与 细 胞器等，在形态结 构上尽可能保持生活 时 的完整和真 实 状 态 ，同时 更易于染色，可以 较 清楚的 显现细 胞在生活 时 不易看清的 结 构。 酸解 的作用是去除未固定的蛋白 质 , 同 时 使胞 间层 的果胶 类 物 质 解体， 细 胞分散而易于 观 察。六、 实验结 果1、首先在低倍 镜 中找到分生 组织 区 细 胞分散均匀，分裂相较 多的部位，再 转 高倍 镜观 察，找到微核。2、微核 识别标 准：（ 1）在主核大小的 1/3以下，并与主核分离的小核。（ 2）小核着色与主核相当或稍浅。（ 3）小核形 态为圆 形、 椭圆 形或不 规则 型。3、每一 处 理 观 察 3个根尖，每个根尖 计 数 100个 细 胞， 统计 其中含微核的 细 胞数， 计 算平均数，即 为该处 理的MCN ，即微核千分率。样 品 实测 MCN 平均 值对 照 组 （ 标 准水） MCN 平均值污 染指 标 （ PI） =微核 微核MNNCE改良：CB法微核 :微核 （ micronuclear）：无着 丝 粒断片（染色体碎片）或在分裂后期落后的整条染色体，在分裂末期不能 纳 入主核，当 进 入下一个 间 期 时 ，它 们 在 细 胞 质 内 浓缩 成小于主核1/3，着色与主核相同或略浅的小核。胞 浆 分裂阻滞微核法 (CB法 )：培养基中加入 胞松素 -B,后者不干 扰细 胞核分裂，但能 阻滞胞 浆 分裂 。分裂一次的淋巴细 胞的胞 浆 中出 现 双 细 胞核 ,简 称 CB细 胞。 CB细 胞大 ,具有双核 ,易于 鉴别 。双核 细 胞是只 经历 一次分裂的 细 胞。 CB法估算 剂 量范 围 ： 0.25-5.0Gy；受照后微核随 时间变 化 规 律 :照射后立刻升高 ,然后保持恒定水平 ,持 续时间 不清；照后尽早采血 ,不超 过 一月； 微核法：直接涂片法、培养法、 CB法；微核 仅 出 现 在 诱发 后 经过 一次分裂的 间 期 细 胞 传统 微核法 不能分辨未 转 化、分裂一次和一次以上的淋巴 细 胞 ,影响微核 测试 的准确性；CB法 计 数 CB细 胞中的微核 ,可 显 著提高微核 检测 的灵敏度和准确性。 MNCB法 优 点：方法 简单 ,分析快速 ,易于掌握 ,有利于自 动 化分析 ,尤其在核事故涉及的人员较 多 时 更 显 示具 优 越性。缺点：不像双着 丝 粒体 对辐 射敏感、特异；自 发 率高， 1 2；个体差异大，自发 率与性 别 无关，与年 龄 呈正相关，估算剂 量下限的不确定性高；衰减速度比双着丝 粒体快。 进 展：稳 定性染色体畸 变 （易位）分析： 荧 光原位 杂 交 (FISH)技 术 利用生物素 (biotin)标记 的 已知碱基序列的 核酸 作 为 探针 ,按照碱基互 补 的原 则 ,与 标 本上 染色体 同源序列 进行特异性 结 合（ 原位 杂 交 ） ,然后用 荧 光 标记 的生物素 亲 和蛋白 (avidin)和抗 亲 和蛋白的抗体 进 行免疫 监测 和放大 ,使探 针杂 交区 发 出 荧 光 (显 色 ),形成可 监测的 杂 交双 链 核酸 ,最后在 荧 光 显 微 镜 下 检查 探 针 存在与否。 结 合了探 针 的染色体呈 现 出特定的 颜 色 ,未 结合探 针 的染色体不着色 ,如着色与未着色的染色体 间发生了互 换 ,这 种异常的染色体在 荧 光 显 微 镜 下非常容易 鉴别 。 14FISHFISH易位易位特点：L FISH与 G显带 相比， 节 省了人力物力 ,由于不需要分散良好的分裂相 ,增加了分析的 细 胞数 ,提高了检测 的精确度。L FISH对结 构畸 变 分析 较 常 规 法快速、准确 ,有望成 为较 理想的生物 剂 量 计 。是当前 辐 射 细 胞 遗传学 发 展中的一 门 前沿技 术 。缺点：