第15章核酸的物理化学性质

第第 15章章 核酸物理化学性质核酸物理化学性质一、核酸的水解核酸可被水解的位点有磷酸酯键和糖苷键，其中糖苷键更易被水解。 5 端3端CGA核酸的酸水解嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定，对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键。 DNA在 pH1.6于 37 对水透析可完全除去嘌呤碱；在 pH2.8于 100 加热 1h，也可完全除去嘌呤碱。核酸的碱水解RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。 DNA的磷酸酯键则不易被碱水解。这是因为 RNA的核糖上有 2 OH，在碱作用下形成磷酸三酯。磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷 2， 3环磷酸酯。该环磷酸酯继续水解产生 2核苷酸和 3核苷酸。DNA一般对碱稳定，若在 1mol/L NaOH中加热至 100 4h，可以得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。核酸的酶水解水解核酸的酶种类很多。非特异性水解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。专一水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶。另外还有非特异水解糖苷键的糖苷酶。 核酸酶的分类 按底物专一性分类：作用于 RNA的称为 RNA酶（ ribonuclease， RNase）；作用于 DNA的称为DNA酶（ deoxyribonuclease， DNase）。按对底物作用的方式可分为核酸内切酶（endonuclease）和核酸外切酶（ exonuclease）。少数核酸酶既可内切又可外切。核酸酶的分类 核酸外切酶有 53 方向切割的，也有 35 方向切割的，分别称为 53 外切酶和 35 外切酶。还有对特定核苷酸序列部位进行切割的。如 :限制性核酸内切酶 二、核酸的酸碱性 质具有芳香环结构特点 能发生酮式 /烯醇式、氨式 /亚氨式互变 嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性_主要是环内氨基的贡献1、碱基的解离胞嘧啶中尿嘧啶及胸腺嘧啶中鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子 则结合到 N7上2、核苷的解离戊糖可增强碱基的酸性解离核糖中的羟基也可发生解离3.核苷酸的解离磷酸基使核苷酸具有很强的酸性 DNA等电点为 4 4.5； RNA等电点为 2 2.5三、核酸的紫外吸收 碱基含有共轭双键 最大吸收峰 260nm左右核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。：摩尔吸光系数A：吸收值W ：每升溶液磷重量L ：比色杯内径 OD260的应用：1. DNA或 RNA的定量 OD260=1.0相当于 50g/ml双链 DNA 40g/ml单链 DNA（或 RNA） 20g/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品 : OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品 : OD260/OD280 = 2.0 含杂蛋白及苯酚，降低3.判断 DNA是否变性四、核酸的变性、复性与杂交(一 ) 核酸的 变性 （ denaturation）1、 DNA的变性 ：在某些理化因素作用下， DNA双链解开成两条单链的过程。某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力， 使核酸分子高级结构改变、理化性质及生物活性发生改变。不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变2、变性的实质降解：核苷酸骨架上 3， 5 -磷酸二酯键的断裂DNA变性的本质是双链间氢键的断裂高温（一般 75 ） 热变性强酸、碱 酸碱变性甲醛 （ Agarose中 RNA ）尿素 （ PAGE中 DNA ）3、变性因素OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失4、变性后理化性质变化RNA变性：从螺旋到线团之间的转变RNA的变性引起的性质变化没有 DNA明显完全变性后核酸紫外吸收值增加： 天然 DNA 25 40%、 RNA 约 1.1% 实质：碱基暴露由于变性或降解引起紫外吸收增加的现象称 增色效应DNA变性5、 DNA热 变性的特征变性过程是 “ 跃变式 ” 的，而非渐变解链曲线： 连续加热 DNA，以温度对A260作图，所得的曲线称为解链曲线 。 指增色效应达 50%时的温度 一般 DNA Tm 值在 85 - 90 C之间 Tm： DNA变性时， OD260达到最大值的 50% 时的温度称为 DNA的 解链温度 或 融解温度 (Tm)。大小与 G+C含量成正比。（ 1） DNA的均一性：（ 2） G C含量：经验公式： XG+C（ Tm 69.3） 2.44（ 3） 介质中的离子强度：Tm值大小与下列因素有关：(二 )核酸 的 复