第十八章重组人红细胞生成素生产工艺

第一节 概述第二节 工程 CHO细胞系的构建第三节 CHO细胞系培养过程与工艺控制第四节 分离纯化工艺第十八章 重组人红细胞生成素生产工艺 概 述18.1.1 红细胞生成素的种类 18.1. 2 红细胞生成素的临床应用 18.1. 3 红细胞生成素的理化性质 18.1. 4 红细胞生成素的表达研究 红细胞生成素第一节 概 述 概 述18.1.1 红细胞生成素的种类 红细胞生成素1、 天然红细胞生成素的生成和作用原理1890：现象，低氧压下红细胞增多1948： Bonsdorff和 Jalavisto，提出红细胞生成素（ erythropoietin， EPO） 动脉氧分压是 EPO生成调节因素概 述红细胞生成素2、 天然红细胞种类 1971年：从贫血羊血桨中分离出羊 EPO1977年：从再障碍贫血患者的尿液中分离纯化出人 EPOhEPO形式： hEPO-及 hEPO-，二者 氨基酸组成及顺序相同 ， 165aa，活性类似 糖基化及其含量不同： EPO-含有较多的 N-乙酰葡萄糖，总含糖量比 EPO-高。概 述红细胞生成素3、 红细胞生成素的生理作用红细胞生成素，又称促红细胞生成素，或红细胞生成 刺激因子：调节红系祖细胞，对红细胞生成有特异性 刺激作用的细胞因子。EPO与靶细胞结合：骨髓、脾、肝细胞等，促进前体细胞增殖和分化，生成 RBC概 述红细胞生成素4、重组人红细胞生成素第一代：两种，天然基因表达， rhEPO-和 rhEPO- 1989： Amgen, Epogen； 1990， Biotech， Procrit rhEPO-， CHO细胞生产 Roche， NeoRecormon(rhEPO-)， BHK细胞系概 述红细胞生成素4、重组人红细胞生成素用基因工程技术生产的人红细胞生成素第二代： EPO突变体 2001， Amgen， Arasnep长效 rhEPO-突变体， 170aa，有 5个 N糖基化位点 唾液酸残基高 2倍，半衰期 36h（ EPO为 4-8h） CHO细胞系生产概 述红细胞生成素适应症：各类贫血起因：慢性肾衰竭、 AIDS、肿瘤、化疗等引起的贫血开发新的临床适应症：肾病和糖尿病在生物制品中排位 NO.1， 2004年全球销售额 11.9BUSD，重磅 炸弹药物 各类体育竞技中，禁止使用的药物 ？18.1. 2 红细胞生成素的临床应用 概 述红细胞生成素大小： 166aa糖链占分子量的 39%糖基化程度与准确性对活性影响很大pI4.2 4.6，对热和 pH变化相对稳定。18.1. 3 红细胞生成素的理化性质 概 述红细胞生成素天然提取制药工艺：由再生障碍性贫血患者的尿液中纯化而得，人源的红细胞生成素。产量极其有限。 （未用生产） 基因工程制药工艺：重组人红细胞生成素（应用生产中） 化学制药工艺：基于红细胞生成素的受体，研究与红细胞生成素功能相当的化学药物（开发中）18.1. 4 红细胞生成素的表达研究 概 述红细胞生成素重组人红细胞生成素工艺路线的研究SV40病毒启动子驱动表达载体，在 COS-1中瞬时表达红细胞生成素 昆虫 SF9细胞中杆状病毒系统表达 rhEPO。产率有所改善，但糖基化程度较小 干扰素 -基因启动子的 rhEPO表达载体， BALL-1细胞，产生较高量的 rhEPO概 述红细胞生成素重组人红细胞生成素工艺路线的研究大肠杆菌中表达，仅具有体外抗原结合活性。家蚕体内的表达系统，糖基化简单，药物在体内稳定性较低、活性较差等问题。 在 CHO、 BHK细胞系统中稳定表达，获得的重组红细胞生成素与天然红细胞生成素相似。现在工业生产中多采用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模生产。第一节 概述第二节 工程 CHO细胞系的构建第三节 CHO细胞系培养过程与工艺控制第四节 分离纯化工艺第十八章 重组人红细胞生成素生产工艺 红细胞生成素第二节 工程 CHO细胞系的构建细胞系的构建18.2.1 表达载体的构建 18.2. 2 转染 18.2. 3 稳定性筛选 红细胞生成素 细胞系的构建18.2.1 表达载体的构建 人红细胞生成素基因的克隆策略：从基因组中克隆编码区片断，拼接成全长；或从基因中克隆全长，在动物细胞中转录出 mRNA， RT-PCR克隆全长序列 将目标基因与载体在连接体系中连接过夜，连接酶为Phage T4连接酶 表达载体的构建：人红细胞生成素基因与载体进行酶切、连接、转化、大肠杆菌中筛选、鉴定、测序、确证序列、方向无误。红细胞生成素 细胞系的构建细胞培养 ： CHO dhfr- 60%汇合；用无血清培养基洗涤 3次脂质复合物制备 ：细胞载体 prEPO和 pDHFR与脂质体混合共感染 ：与无血清培养基混合，加到培养皿中， 37 ，5%CO2， 4h 抗性克隆的获得 ：在相关的培养基中培养后进行抗性筛选18.2. 2 转染 红细胞生成素 细胞系的构建18.2. 3 稳定性筛选 胰蛋白酶消化， 1:5稀释，在含有 1 nmol/L MTX培养基上培养， 3 4d更换培养基，培养 10 14天，至抗性克隆出现。 传代培养： 1:5稀释，按 1 nM5 nM25 nM100 nM200 nM1000 nM使 MTX浓度逐次升高，筛选抗性克隆。 抗性克隆培养于 100 mm培养皿中，按 1:500稀释，继续培养 3 5天，集落 2-4 mm。 酶联免疫分析：确认表达人红细胞生成素。第一节 概述第二节 工程 CHO细胞系的构建第三节 CHO细胞系培养过程与工艺控制第四节 分离纯化工艺第十八章 重组人红细胞生成素生产工艺 红细胞生成素转瓶生产： Amgen 公司反应器生产rhEPO的大规模生产方式培养过程与工艺控制红细胞生成素第三节 CHO细胞系培养过程与工艺控制培养过程与工艺控制18.3.1 种子细胞制备18.3. 2 反应器培养工艺18.3. 3 培养过程控制红细胞生成素冻存的细胞株 37 水浴，无菌离心。加适量 DMEM培养基（ 10%小牛血清）。37 、 CO2培养箱培养，连续传三代。细胞消化后接种，制成接种细胞浓度 (2.5106个 /ml)。培养过程与工艺控制18.3.1 种子细胞制备红细胞生成素反应器灭菌：加纤维素载体片及 pH7.0的 PBS缓冲液，高压灭菌 1.5h。 接种：排出 PBS缓冲液，加 DMEM培养基，接种。 贴壁培养： pH7， 50r/min， 37 ， DO50-80%。 扩增培养： 80 100r/min，培养 10d。 灌流培养：控制温度、 DO、 pH值等培养条件，进行无血清培养基连续培养。 收获培养物， 4 8 保存。培养过程与工艺控制18.3. 2 反应器培养工艺红细胞生成素搅拌控制：接种后，搅拌速度缓慢，使细胞贴附于载体上，随着细胞数量的增加逐渐提高搅拌速度。 温度控制：较为严格，恒定 37 。 pH值控制： 7.0-7.2,输入 CO2和碳酸氢盐溶液维持其恒定。溶解氧控制：在 50 -80的范围内，通入氧气、空气或氮气的比例混合气体。 葡萄糖控制：流加补料。 代谢废物控制：监测氨、乳酸盐类等，维持较低浓度，减少对细胞损害。培养过程与工艺控制18.3. 3 培养过程控制第一节 概述第二节 工程 CHO细胞系的构建第三节 CHO细胞系培养过程与工艺控制第四节 分离纯化工艺第十八章 重组人红细胞生成素生产工艺 红细胞生成素 培养过程与工艺控制18.4.1 初级分离18.4. 2 精制纯化18.4. 3 产品质量控制第四节 分离纯化工艺红细胞生成素CM Sephrose亲和层析 ： Na-HAc-异丙醇活化，并用20 mmol/L Tris-HCl平衡缓冲液平衡 。 收获培养基滤膜过滤后上 CM亲和层析柱，平衡缓冲液平衡。 0 2 mol/L NaCl， 20 mmol/L Tris洗脱液梯度洗脱。 透析： 0.1mM Tris，过夜，换液 4次。培养过程与工艺控制18.4.1 初级分离将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。 红细胞生成素 培养过程与工艺控制亲 和 层 析法的四 项 要素：(2)SpecificBindingSubstance (B)洗脱Elution(4)配 体Ligand (A)耦合反 应 (3)Coupling Reaction杂质BBBB(1)Solid MatrixB红细胞生成素 培养过程与工艺控制亲和层析法的作用机理：固相 载体(1) (2) (3)ABSampleWashing ElutionX B亲和基团配体X BA A红细胞生成素 培养过程与工艺控制SDS-PAGE亲 和 层 析法 纯 化CHOMTrypsinA B C&D Disc-PAGEA B C = D以 凝胶电泳检验亲和层析操作 过程各步骤样品 Chitin红细胞生成素透析后的活性组分上预先平衡的 DEAE离子交换柱。0 1 mol/L NaCl-