第2章蛋白质和主要必需氨基酸的测定

第二章 蛋白质和主要必需氨基酸的测定第一节 概述l 蛋白质是植物的重要组成成分，也是 农产品品质中最重要的成分 。l 它的含量依作物种类、部位、生育时期、品种特性而有变化。植物各部位器官中蛋白质含量也不同， 其中以籽粒中最多 ，如豆类可达 45 -55，其次是花、叶、茎和根。l 作物在不同的生育阶段根部位吸收的氮，不断向新生组织输送，在接近成熟时期，茎叶中的氮向贮存器官输送，合成的蛋白质集中于 种子 中。 各种农产品中蛋白质的含量水平（ %） 作物 蛋白 质（干基） 作物 蛋白 质（干基） 作物 蛋白 质（干基） 作物 蛋白 质（干基）菜豆洋扁豆速豌豆蚕豆大豆亚 麻向日葵 (仁 )棉籽 (仁 )小麦黑麦15.030.524.634.122.034.027.035.029.450.42.030.821.130.228.642.019.330.014.424.1大麦燕麦稻米玉米小米 (仁 )高梁荞 麦 (仁 )10.620.48.017.37.814.59.013.210.221.59.515.312.819.0马铃 薯冬油菜甜菜萝 卜胡 萝 卜洋葱大蒜菠菜芹菜番茄0.72.71.01.50.71.40.61.20.61.91.92.86.72.31.33.60.30.8茄辣椒南瓜黄瓜甘 蓝花椰菜浆 果核桃高梁叶高梁茎0.61.20.71.10.41.00.50.91.22.62.40.31.916.128.912.417.54.07.5l 蛋白质是生命的物质基础，它的含量是衡量农、畜、水产品品质和营养价值的重要指标。l 测定植物各部分中蛋白质的含量，对其 品质鉴定、品种选育、改善作物生育条件和调节作物体内新陈代谢和提高蛋白质含量 等有重要意义。l 对产品加工方式及其产品质量有影响。l 在育种、食品和饲料等工作中常常需要测定蛋白质的含量。 为什么要测定蛋白质？l 氨基酸是组成蛋白质的基本单位 ，也是蛋白质的分解产物。l 氨基酸的分析测定是研究蛋白质、酶的化学组成及性质的重要手段。l 动植物产品中的氨基酸以多种形式存在，大致可分为 构成蛋白质的氨基酸和游离的氨基酸 两种。l “第一、第二限制氨基酸 ”的赖氨酸和色氨酸 ，是必需氨基酸，但 人类和动物自身无法合成 ，须从食物中直接吸收。l 氨基酸的含量是衡量谷物、饲料蛋白质的重要标准之一。为什么要测定氨基酸？l 蛋白质的分析方法很多，可分为两类：(1)利用蛋白质的共性，即 含氮量；(2)利用蛋白质中 特定氨基酸残基、酸 (碱 ) 性基团和芳香基团测定蛋白质含量。l 最常用的方法是 开氏（凯氏）法 测定含氮量。l 粗蛋白质： 开氏法测定结果中因其含有氨基酸、酰胺等非蛋白质氮，故称 “粗蛋白质 ”l 纯蛋白质： 开氏法测定中，如果蛋白质用重金属盐等沉淀分离以后，进行全氮测定，由氮换算而成的蛋白质的含量，则称为 “纯蛋白质 ”。 第二节 蛋白质的测定l 籽粒中粗蛋白质的测定l 同类种子中蛋白质的测定 (染料结合 -DBC法 )l 同类种子中蛋白质的测定 (双缩脲法 )蛋白质测定方法介绍一、籽粒中粗蛋白质的测定H2SO4-K2SO4-CuSO4-Se消煮法（开氏法）l 方法原理 ： 植物中的蛋白质含量基本上是不变的。可用开氏法消煮定氮，再将测得的含氮值乘以蛋白质换算系数，即得粗蛋白质含量。l 换算系数： 平均 6.25 蛋白质平均含氮 16% ，不同植物籽粒换算系数见 P286表 14-2。注意问题l 籽粒样品在开氏法分解时， 硝态氮的部分氨化 是不可避免的。l 因此， 蔬菜类 特别是可能含有硝态氮的化合物的样品，需要用 水杨酸固定硝态氮化合物 ，然后用开氏分解测定总氮量，同时用离子电极法测定硝态氮的含量，再从 总氮量减去硝态氮量后乘以蛋白质换算系数 即得蛋白质含量。 l 开氏法 是测定全氮量的经典方法，是丹麦人开道尔(J.Kjeldahl)于 1883年用来研究蛋白质变化的，后来被用于测定各种形态的有机氮。l 设备简单易得，结果可靠，为一般实验室所采用。至今尚无别的方法能与其比拟或将其取代。因此国际谷物化学协会 (ICC)和美国分析化学家协会(AOAC)以及我国都把开氏法作为 标准 的分析方法。开氏法介绍l 开氏法 是测定全氮量的经典方法，是丹麦人开道尔于1883年用来研究蛋白质变化的，后来被用于测定各种形态的有机氮。l 开氏定氮法： (Kjeldahl determination)：在 有催化剂的有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液（硼酸）吸收，再以标准酸滴定为过量的酸液（硼酸）吸收，再以标准酸滴定 ，即可计算出样品中的氮量。开氏法介绍有机氮 铵盐 NH3 NH4+l 开氏法也有 缺点 ，主要是 操作手续较繁，分析的速度较慢，试剂费用较高 。l 近年已出现几种以开氏法原理为基础的全自动或半自动的开氏定氮仪。l 瑞典的 Tecator公司生产的开氏 1030分析仪 (Kjeltec Auto 1030 Analyzer)、日本生产的 kjel-Auto自动氮和蛋白质分析仪和丹麦 FOSS公司生产的 KjelFOSS自动蛋白质分析仪等。开氏法介绍二、仪器设备l 消煮炉或电炉l 消煮管 (或开氏瓶 )100mL或 50mLl 半微量定氮装置l 半微量滴定管 三、试剂l 20 g L-1 H3BO3 指示剂溶液：称取 H3BO3 (分析纯)20g溶于 1L水中。每升 H3BO3溶液加甲基红 -溴甲酚绿混合指示剂 20mL，并用稀酸或稀碱调节至紫红色(pH=4.5)。l 0.01 mol L -1(1/2H2SO4)或 0.02 mol L -1 HCl标准溶液。l 其他试剂同 第四章 (土壤全氮的测定 )。(1) 样品的消煮称取烘干样品 (过 0.25mm筛 ) 0.3000 0.5000g置于 50mL或100mL开氏瓶或消煮管中，加入 混合催化剂 1.8g，加几滴水湿润后，加 5mL浓 H2SO4，小心轻摇后 (最好加塞放置过夜 )，盖上 小漏斗 ，将消煮管放置在 消煮炉 上，开始时用小火加热，待消煮液呈棕色时，可提高温度，消煮至溶液呈清亮带浅蓝色时，再加热约 10min，取下冷却至温热时，将消煮液无损地转入 100mL容量瓶中，冷却至室温后定容并放置澄清。 四、操作步骤（ 2）氮的测定用移液管吸取澄清待测液 5.00或 10.00mL放入半微量定氮仪中进行定氮。同时作空白试验和核对试验。 见教材 P46四、操作步骤凯氏定氮仪 半自动l 氮含量换算成蛋白质的系数，一般采用 6.25，这是由蛋白质平均含氮 16% 为根据导出的值，但不同植物籽粒中蛋白质的含氮量有 差异 ，故由氮换算为蛋白质的系数也稍有不同， P286。l 以 定量蛋白质为目的的总氮量测定 中，开氏法分解时，硝态氮的部分氨化是不可避免的，因此 蔬菜类 特别是可能含有硝态氮的化合物的样品，需要用 水杨酸固定硝态氮化合物 ，用开氏分解测定总氮量 ;同时用 其他方法 测定硝态氮的含量，再从总氮量减去硝态氮量后乘以蛋白质换算系数即得蛋白质含量。 注意问题l 本法测定的结果为 粗蛋白质 的含量。l 如要测定纯蛋白质的含量，则样品应先用蛋白质沉淀剂碱性硫酸铜、碱性醋酸铅、 200gL-1 250gL-1单宁或 100gL-1三氯乙酸等处理，将蛋白质从水溶液中沉淀出来，再测定此沉淀的全氮量，乘以蛋白质的换算系数即可得： “纯蛋白质 ”量。注意问题方法原理方法原理蛋白质中的 碱性氨基酸 (赖氨酸、精氨酸和组氨酸 )的 -NH2、咪唑基和胍基以及蛋白质末端自由氨基 在 pH=2 3的酸性缓冲液体系中呈 阳离子状态 存在，可以和 偶氮磺酸染料类 物质如 橘黄 G等的阴离子结合，形成 不溶于水的蛋白质 -染料络合物 而沉淀下来，通过测定一定量样品与一定量体积的已知浓度染料溶液反应前后溶液中染料浓度的变化，可计算出样品的染料结合量，即每克样品所结合的染料的毫克数。二、同类种子中蛋白质的测定 (染料结合 -DBC法 )l 主要仪器l 试剂l 操作步骤l 结果计算l 参见教材 P286二、同类种子中蛋白质的测定 (染料结合 -DBC法)l 该法是 间接测定 种子中蛋白质的方法。方法简单、快速，与开氏法的相关性较好，但 准确性较差 ，适用于大批同类样品的筛选工作。l 不适用 随意混合物的样品的测定 。l 如在 筛选同种作物种子 的大批样品时，不必知道蛋白质的绝对含量，只要测定样品的染料结合量即可进行比较。注意问题方法原理 l 蛋白质的 肽键肽键 结构，具有类似于双缩脲的反应基团。在碱性条件下能与 Cu2+生成 紫红色可溶性络合物 ，蛋白质含肽键多时反应呈紫色，反之肽键少时，反应呈红色。这种颜色反应称为双缩脲反应 (或称缩二脲反应 )。l 实验证明，蛋白质溶液浓度在 1-15mg之间，其呈色溶液的吸收值与蛋白质含量成正比关系。故可用此反应进行蛋白质的测定。 三、同类种子中蛋白质的测定 (双缩脲法 )l样品处理与测定参见教材 P289。三、同类种子中蛋白质的测定 (双缩脲法 )l 适用于 大批品种筛选、育种 等工作中的蛋白质测定。l 一般的生化分析中采用的双缩脲试剂是 碱性硫酸铜水溶液 ，不适用于种子蛋白质的分析，因为它不稳定，而且会浸出有色物质、脂肪及一些淀粉物质，干扰比色测定。而 异丙醇双缩脲试剂 ，可以减少这些物质的溶解， 排除干扰 。l 本法对 温度及时间 的要求严格，否则再现性不高。采用室温 20-25 ，须于 120 190min内比色； 40 为