细菌染色和涂片观察的方法

细菌的染色和涂片观察第一节 不染色标本检查法l所谓不染色标本检查法是将细菌标本不经染色直接镜检，从而观察生活状态下细菌的形态及运动状况的一种检查方法。这种检查方法虽可看到细菌的大致轮廓，但主要用于观察细菌的动力。一、不染色标本检查法的具体方法l1 、压滴法l2、悬滴法l3、毛细管法第二节 染色标本检查法l所谓染色标本检查法是用特殊的手段对细菌进行染色，而后再检查其形态、大小、排列方式、染色反应以及特殊结构的一种检查方法 ,有助于细菌的初步识别或诊断。细菌染色的一般程序l细菌染色的基本程序是：l涂片 固定 （媒染） 染色 （脱色） （复染）1、 涂片制备：l随标本的种类而略有不同。一般临床标本大多可直接涂抹于洁净载玻片上；培养的细菌，若为液体培养液，亦可直接涂于载玻片上；若为固体培养基上的细菌，则先取一接种环生理盐水于载玻片中央，然后从培养基上取菌少许，在盐水中研磨均匀，使呈轻度乳浊，以接种环扩成 1cm2或 2份硬币大小的涂面，在室温下自然干燥或放在火焰上方的热空气中慢慢烘干。但切忌紧靠火焰烤干。2、 固定：l染色前必须先行固定。其目的在于凝固细胞质和其它细胞结构成分而杀死细菌；使菌体粘附于玻片上以及改变细菌对染料的通透性（因活菌通常不易使染料透入细胞内）。l 固定的方法一般采用火焰加热法，在特殊目的时也可用冷冻干燥法或化学法如醇、酸、氯化高汞、重金属盐或氧化剂等进行固定。3、 媒染：l媒染的目的是增加染料和被染物的亲和力。凡使染料固定于被染物；或引起细胞膜通透性改变的物质统称为媒染剂。常用的媒染剂有明矾、苦味酸、金属盐、碘等。也可用加热法媒染。媒染剂可用于固定之后，亦可含于固定液或染液中，也可在初染之后复染之前进行。4、 染色：l随目的而选用适宜的染液。染色时，滴加染液以覆盖涂面为度，染色时间随方法而定。单染法只用一种染料如吕氏美兰、稀释石炭酸复红等；而多数染色法需用第二种染液进行复染。5、 脱色：l脱色：是使被染物脱去已染上的颜色。脱色的目的是观察细菌与染料结合的稳定程度，故可作为鉴别染色之用。l凡具有脱色作用的化学试剂称脱色剂。脱色剂或呈溶媒作用，如醇类、丙酮等；或能影响蛋白质的电离程度，改变其电荷性质或数量，因而影响细菌与染料的结合程度，如酸类能减少细菌的负电荷，故可作碱性染料的脱色剂。6、 复染：l已经脱色处理的细胞或其结构常以复染液作复染以便于观察。复染液与初染液的颜色不同而成鲜明对比，所以复染也称为对比染色。复染液不宜太强，以免掩盖初染的颜色而失去对比作用。常用染色法l细菌的常用染色法有：单染色法、复染色法、特殊结构染色法、负染色法以及荧光染色法等。（一）、单染色法： l单染色法是指用一种染料进行染色的方法。如用美兰或稀释石炭酸复红等，使各种细菌均染成同一种单一的颜色。故此法只能显示细菌的形态及大小，对细菌的鉴别价值不大。（二）、复染色法 ： l复染色法是用二种以上染料进行染色的方法。此法除显示细菌的形态、大小外，还有鉴别细菌种类的价值，因此也称鉴别染色法。常用的鉴别染色法有革兰氏染色法及抗酸染色法。1、 革兰氏染色法（ Grams Stain）l是最常用的鉴别染色法之一。此染色法是由丹麦细菌学家 Christian Gram氏于 1882 1884年发明的，至今已逾百年，仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色方法。（ 1）、革兰氏染色的方法：固定 初染 媒染 脱色（结晶紫或龙胆紫） （ 卢戈氏碘液） （ 95%酒精） 复 染（稀释复红）固定 初染 媒染 脱色 复染 革兰氏阳性菌，用符号 “G+”或 “GP” （ Grams Positive） 表示。 革兰氏阴性菌，用符号 “G”或 “GN”（Grams Negative） 表示。 革兰氏阳性葡萄球菌例子 (金黄色葡萄球菌 x 1000)革兰氏阳性链球菌例子革兰氏阴性杆菌例子 (大肠杆菌 x 1000)革兰氏阴性弧菌例子革兰氏阳性产芽孢杆菌例子 革兰氏阳性短杆菌例子 (李斯特菌 x 1000)革兰氏阴性弯曲菌例子革兰氏阳性棒状杆菌例子革兰氏染色的结果与培养基成分、培养条件、操作技术及菌龄等有密切的关系。培养基成分： 在缺乏镁盐的培养基中，革兰氏阳性菌可变为革兰氏阴性菌。培养条件： 在酸性环境中细菌带正电荷。操作技术： 如涂片太厚影响酒精脱色，革兰氏阴性菌则可染成革兰氏阳性菌；脱色时倘酒精作用时间太长，革兰氏阳性菌又会染成革兰氏阴性菌。菌龄： 菌龄也能影响染色的结果，这和细菌生长过程中核酸含量的改变有关。例如本是革兰氏阳性的老龄菌，因核酸减少则常有许多菌细胞变为革兰氏阴性。革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖含量较多，脂类较少，与 95%酒精接触后可迅速导致细胞壁脱水，通透性降低，使在细菌细胞内着色的染料 结晶紫与碘的复合物不易透出，所以保留了紫色。而革兰氏阴性菌细胞壁含肽聚糖较少、脂类较多，与 95%酒精接触后肽聚糖脱水不明显，而脂类被酒精溶解后使细胞壁通透性增加，酒精易透入菌体内溶解染料碘复合物并使其透出，因而使紫色被洗脱后又被染成红色。3）、革兰氏染色法的临床意义l 、鉴别细菌：该染色法可将细菌分为 GP菌与 GN菌两