脂肪干细胞614

动物科技学院 脂肪间充质干细胞脂肪间充质干细胞杨公社Adipose-derived MesenchymalStem Cells汇报提纲研究背景研究背景脂肪干细胞优点及表面标记脂肪干细胞优点及表面标记多向分化潜能多向分化潜能猪脂肪干细胞分离培养、诱导分化及其建系猪脂肪干细胞分离培养、诱导分化及其建系应用前景及待解决的问题应用前景及待解决的问题一、研究背景动物体内，脂肪组织不仅是重要的能量贮存库和赋形组织，还是保持内环境稳定及具有分泌激素和细胞因子的重要部位。脂肪细胞增殖与分化失常是导致肥胖及 型糖尿病的重要因素。因此，脂肪细胞分化的研究一直是国内外医学及生物学领域的研究热点之一。 干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞。干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞。 目前的目前的 成体干成体干细胞细胞 主要是骨髓来源的间充质干细胞。主要是骨髓来源的间充质干细胞。 胚胎干细胞胚胎干细胞 因道因道德伦理问题限制了其应用。骨髓来源的间充质干细胞是德伦理问题限制了其应用。骨髓来源的间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的细胞，但骨髓穿刺给病人带来一类具有多向分化潜能的细胞，但骨髓穿刺给病人带来的痛苦大，且只能得到少量细胞的痛苦大，且只能得到少量细胞 (大约大约 1个间充质干细胞个间充质干细胞/105基质支持细胞基质支持细胞 )，因而存在取材困难、病人不易接受，因而存在取材困难、病人不易接受的缺点。因此，国内外研究人员积极寻找可替代的干细的缺点。因此，国内外研究人员积极寻找可替代的干细胞来源。胞来源。 背景知识2001年年 Zuk等首次从病人脂肪组织悬液中分离等首次从病人脂肪组织悬液中分离获得了有多向分化能力的细胞，并将其命名为抽脂获得了有多向分化能力的细胞，并将其命名为抽脂处理细胞（处理细胞（ PLA）。）。 PLA在特异性诱导剂下可分化为在特异性诱导剂下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。之后成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。之后，多个研究小组相继证实，脂肪组织中确实存在着，多个研究小组相继证实，脂肪组织中确实存在着与骨髓间充质干细胞相似的成体干细胞。脂肪间充与骨髓间充质干细胞相似的成体干细胞。脂肪间充质干细胞的发现进一步拓宽了脂肪组织领域的研究质干细胞的发现进一步拓宽了脂肪组织领域的研究。背景知识二、脂肪源间充质干细胞的优点首先，从人类医学角度说，获取脂肪间充质干细胞比骨髓源性干细胞容易的多。皮下脂肪切除术是一种普通的外科手术，其安全性高、对患者带来的痛苦小。即 AMSCs具有易获得性、安全、可迅速扩增及多向分化能力等特点，其将成为具有广阔治疗应用前景的一类成体干细胞。 其次，脂肪组织比骨髓中所含干细胞比率大。 通过成纤维细胞集落形成单位比较脂肪组织显示，成人骨髓来源细胞中成纤维细胞集落形成单位出现频率为 1/50000 1/1000000，而当脂肪组织用胶原酶消化，除去上层漂浮的成熟脂肪细胞，下层细胞中成纤维细胞集落形成单位的频率为 1/100，说明脂肪组织中 干细胞数目至少是骨髓的 500多倍 。脂肪间充质干细胞优点最后，从经济和社会效益看，从脂肪组织中获取干细胞可将原本认为是废弃物的脂肪，如临床上脂肪抽吸术后的脂肪组织及动物屠宰后不可实用的内脏脂肪等变为干细胞库的重要来源，具有极大的经济与社会效益。脂肪间充质干细胞优点关于脂肪间充质干细胞标志，目前尚无统一标准。一般认为，脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞均表达 CD44、 CD105、 STRO-1、CD166及 CD117。其中 CD117是一种干细胞因子受体，在全能或多能干细胞中表达，包括胚胎干细胞。表面标记除了上述几种标记外，脂肪间充质干细胞也表达其他多种分子标记，包括 CD29（ 1-整合素，在血管发生治疗中起重要作用）、 CD44（透明质酸盐）和 CD49e（ 5 -整合素，在细胞粘附纤连蛋白中起重要作用）等。表面标记不同研究组对脂肪间充质干细胞表面标记的鉴定结果并不完全一致，如 Gronthos等发现AMSCs不表达 STRO-1，但 Zuk等发现表达 STRO-1。这些不一致的结果可能与细胞所处状态及纯度有关。 表面标记报 道文献 AMSCs表面 标记阳性 阴性Gronthos，2001CD44、 CD49d、 CD49e、CD54、 CD55、 CD59、CD105、 CD106和 HLA-ABCCD14、 CD45、 CD50、CD56、 HLA-DR和骨髓基 质细 胞表面分子STRO-1Zuk， 2002 CD13、 CD29、 CD44、CD105、 CD71、 STRO-1CD14、 CD16、 CD31、CD34、 CD45、 CD106、CD56De Ugarte，2003CD13、 CD29、 CD44、CD105、 CD90、 STRO-1CD49d、 CD54、 CD34、 CD106Aust， 2004 CD10、 CD13、 CD29、 CD44、 CD90、和 HLA-ABCCD11b、 CD45和 HLA-DR表面标记近几年的研究结果表明， 在合适诱导剂下，脂肪间充质干细胞和骨髓干细胞一样， 可向脂肪、软骨、成骨、神经元细胞、成肌细胞、血管内皮细胞等方向分化。三、多向分化潜能多向分化潜能Strem BM, 2005多向分化潜能分化方向 相关文献骨骼肌 Mizuno, 2002； Bacou, 2004； 陈希平 , 2004心肌 Rangappa, 2003； Planat-Benard, 2004； Yamada, 2006(棕色脂肪组织 )； 张端珍 , 2005； 王燕 , 2005成骨 Zuk, 2001, 2002； Halvorsen, 2000； Hattori, 2004；陈希哲 , 2004软 骨 Huang, 2004； Winter , 2003； 严笠 , 2005脂肪 Zuk, 2001, 2002； Sen, 2001； Von Heimburg D, 2001神 经 Safford, 2004； Ashjian, 2003； Rchman, 2004； 杨立业 , 2003, 2004脂肪间充质干细胞向不同细胞分化是在特异性诱导因子作用下进行的。下面介绍常用的一些多向诱导分化因子及诱导后的细胞特性。多向分化潜能细 胞 类 型 诱导 物 细 胞特性 脂肪 细 胞 地塞米松 ,异丁基甲基黄嘌 ，胰 岛 素等 细 胞中充 满 脂滴，油 红 o染色阳性成骨 细 胞 2-磷酸抗坏血酸 , -甘油磷酸 ，地塞米松等 钙 化性基 质产 物 ，茜素 红 染色阳性骨骼肌 细 胞 地塞米松， 氢 化可的松，或 5-氮 杂 胞苷 多核形 态 ，骨骼肌肌性素重链 /MyoD表达 心肌 细 胞 5-氮 杂 胞苷 细 胞 圆 形， -肌 动 蛋白和肌钙 蛋白 -I表达 神 经 元 细 胞 -巯 基乙醇或者异丁基甲基黄 嘌 , 消炎痛等 细 胞 缩 小、周 围 有多个神 经突起 内皮 细 胞 血管内皮 细 胞生 长 因子，碱性成 纤维细 胞生 长 因子 细 胞之 间 形成网格 样结 构 ，表达内皮 细 胞特异性抗原 肝 (实质 )细胞肝 细 胞生 长 因子， 抑瘤素 M表达白蛋白和 -胎蛋白 肝实质细胞在 2006年 4月第 16卷 4期的自然科学进展上，裴雪涛等人发表的文章 人脂肪来源的干细胞体外培养特性及分化为肝细胞样细胞的研究 。脂肪源性干细胞的分离因物种不同消化方法不同。 本实验室采用型胶原酶消化法分离获得猪脂肪源干细胞，表达脂肪干细胞表面标记，在合适诱导剂下，这些细胞分化成了成骨细胞、成肌细胞和脂肪细胞，在此作一简单介绍。四、猪 AMSCs的培养及诱导分化细胞培养 7-8 天后，细胞生长即可达 80 %-90 % 融合，贴壁细胞紧密排列成漩涡状、网状、辐射状，有一定的方向性，集落大小不一，含数个至数百个细胞不等；集落中细胞形态为典型梭形细胞(图 A)，这就是我们所要分离获得的猪 AMSCs。原代培养 14 d 左右即可形成致密单层 (图 B)。 BAAMSCs的培养特性CD44+ (50) CD105+ (100) CD14 (50) CD34 (100) CD106 (100) HLA-DR (50) 利用免疫组织化学方法检测猪 AMSCs特异性表面标记，结果： CD44和 CD105呈阳性。 CD14， CD34,CD106,HLA-DR均为阴性。AMSCs的表面标记在地塞米松、抗坏血酸和 磷酸甘油钠的诱导作用下，猪脂肪间充质干细胞逐渐由成纤维样的长梭形（对照组，图 A）变为成骨样的方块形，细胞堆积呈卵圆形或方形（图 B） 。A B成骨诱导成骨诱导后的形态学观察B茜素红染色 检测诱导细胞的矿物质沉积状况，结果：猪脂肪间充质干细胞在成骨诱导第 7天开始出现小的点状钙化斑（ A），诱导第 14天形成广泛的钙化结节（ B）。诱导 21天钙化结节更加明显连接成片（ C）。 D为对照组。CB成骨诱导 actinOCN 165bpCOL-1 539bp actinRT-PCR检测成骨标志基因 COL- 1 （ 型骨胶原）及 OCN（骨钙素）表达 M: marker; 1-4分别为第 0天， 7天， 14天， 21天 OCN的表达 ; 5-8为 COL- 1的表达。结果：在成骨诱导分化的早期（第 7天），可检测到成骨特异性基因 型骨胶原和骨钙素的表达，随着诱导时间的增加， 2个基因的表达量呈上升趋势。成骨诱导RT-PCR检测标志基因 mRNA的表达上述结果说明：在合适诱导剂下，猪脂肪间充质干细胞形态和排列均发生变化，成纤维样的长梭形变为成骨样的方块形，细胞堆积呈卵圆形或方形，茜素红染色和 RT-PCR均表明可以诱导分化成骨细胞。成骨诱导成肌诱导第 7天出现细胞球形变化 (A)，诱导第 14天开始出现接触、融合。部分出现伪足，形态变长 (B)，诱导第 21天周围梭形细胞明显减少，形成巨大的球形细胞 (C,D)。上图为 茜素红染色。A BDC成肌诱导成肌诱导后的形态学观察成肌诱导后肌红蛋白 (myoglobin)免疫荧光染色成肌诱导第 14天，可检测到肌红蛋白 (myoglobin)的表达 (图 A)，第 21天表达明显增加（图 B)。成肌诱导免疫荧光染色-actin 399 bpMyoD 243 bp Myf5 154bp上图是用 5-氮杂胞苷诱导 1周后的结果，由图可以看出 , 诱导一周后即可检测到成肌细胞分化早期表达基因 Myf5和 MyoD的表达。RT-PCR 检测成肌标志基因的表