第六章高通量筛选技术

高通量 筛选 技 术High throughput screening 王 陶2012年 2月高通量 筛选 最初是伴随 组 合化学而 产 生的一种 药 物 筛选 方式。1990年末， 组 合化学的出 现 改 变 了人 类获 取新化合物的方式，人 们 可以通 过较 少的步 骤 、在短 时间 内同 时 合成大量化合物，在 这样 的背景下高通量 筛选 的技 术应 运而生。高通量 筛选 技 术 可以在短 时间 内 对 大量候 选 化合物完成 筛选 ，经过 近十年的 发 展，已 经 成 为 比 较 成熟的技 术 ，不 仅仅应 用于 对 组合化学 库 的化合物 筛选 ， 还 更多地 应 用于 对 现 有化合物 库 的 筛选 。目前世界各大 药 物生 产 商都建立有自己的化合物 库 和高通量 筛选 机构， 对 有潜力形成 药 物的化合物 进 行篦梳式的 筛选 。我国药物高通量筛选起步较晚，且不规范，仅有十多年的研究历史。1996年中国医学科学院引进国内第一台 Bionek2000型实验自动化工作站；1998年又引进全国第一台 Topcount微量闪烁计数器，使放射配基实验、放射免疫实验等技术微量化、自动化。上海药物研究所、北京军事医学科学院分别成立了药物筛选专门机构，开始从事大规模筛选工作。西安交通大学药学院贺浪冲教授首创的 细胞膜色谱 （ CMC）为化合物的体外高通量筛选提供了高选择性、高特异性、高效率的筛选手段。 CMC已成功用于 钙离子拮抗剂受体配体结合反应 的研究，目前正在进行心血管化学合成药物的高通量筛选和中药有效部位及有效成分的寻找。今年将建立CMC自动化筛选体系，促进我国药物高通量筛选技术的全面发展 。概念l 高通量 筛选 (High throughput screening， HTS)技术 是指以分子水平和 细 胞水平的 实验 方法 为 基 础，以微板形式作 为实验 工具 载 体，以自 动 化操作系 统执 行 试验过 程，以灵敏快速的 检测仪 器采集实验结 果数据，以 计 算机 对实验 数据 进 行分析 处理，同一 时间对 数以千万 样 品 检测 ，并以相 应 的数据 库 支持整体运 转 的技 术 体系。l 高通量 细 胞 筛选 技 术 (high-throughput cell-based screening technology) 是以高通量方式研究基因功能最有效的方法之一。通常 ,基因功能的初步 筛选在 96 孔或 384 孔板上 进 行 ,通 过 基因 转 染将候 选 基因 导 入 细 胞 ,或直接将基因表达 产 物加入 细 胞培养液中。 是 20世 纪 80年代后期 发 展起来的一种 筛选 新技 术 。它集 计算机控制、自 动 化操作、高灵敏度 检测 、数据 结 果自 动 采集和处 理于一体， 实现 了 筛选 的快速、微量、灵敏和大 规 律，日 筛选 量达到数万甚至数十万 样 品次，是 筛选 技 术 和方法的一大 进步。l 筛选测 定方法基于要研究的生物学或医学 问题 ,例如 ,要研究抗血管生成活性 ,选 用内皮 细 胞 进 行 细 胞生 长 、分化、迁移和粘附等分析 测 定 ;研究免疫 调节 活性 ,可 选择 淋巴 细 胞或造血 细 胞 进 行 细 胞生 长和分化的分析 测 定 ;研究神 经营 养因子活性 ,可 选 用神 经细 胞 进 行 细 胞存活、突起生 长测 定。除上述与 细 胞表型或形 态 学相关的 检测 指 标 外 ,细 胞信号转导 通路、糖代 谢 、能量 产 生和代 谢产 物分析(metabolic control analysis) 等代 谢 通路也是基因功能重要的研究内容。 l 结 合抗体芯片技 术 、多路 测 定技 术(multiplexing) 等新的 检测 方法 ,高通量 细 胞筛选 的 应 用更 为 广泛。另外 ,随着 荧 光成像读 板 仪 (fluorescence image plate reader ,FLIPR) 、定量 PCR、高通量 荧 光激活 细 胞分 类 器 (HT-FACS) 等 检测 方法和技 术 的不断 发 展和 应 用 ,灵敏度和重 现 性 这 两个高通量 细 胞 筛选 的关 键问题 也逐步得以解决。 一、高通量 筛选 常用 仪 器 设备Whatman过滤 型做孔板是种多孔形状物体，便于快速和批量 处 理 样 品。板上刻有号 码 适合于各种微孔板配用 仪器和白 动 控制装置。Boekel 微孔板振 荡 器的特点独立 设 定温度，振 荡 速度和混合 时间 ；混匀器可以 编 程 设 定运行一定 时间 或者瞬 时 混合 3秒；内置的盖可以减少 污 染， 样 品 挥发 或者噪音的危 险 。多通道移液器连续 移液器一次性吸取大量液体，然后每次按动 按 钮 ，仅仅释 放小量等体 积的液体。大量液体 进 行等体 积 分装215全自 动 移液工作站 1.大容量，可自 动处 理 12个 96孔反 应 板或 480个 试 管的 样 品。 2.特 别 适合于 HPLC或 LC/MS的 样 品 处 理。 3.使用 709软 件，有易用的 图 示管架 编辑 器。 4.无 论 开口 试 管或密封 试 管都有很高精确度。 5.Micro215进样 量可低至 0.5ul。 6.多通道 215自 动样 品 处 理系 统 可同 时处 理 8个 样 品。 多功能 酶 标仪 （多功能微孔板 检测仪 ）微孔板 检测设备 之一，集成 4大功能模块 ，可 进 行放射性 /非放射性 检测 。流式 细 胞 仪C6 流式 细 胞 仪 系 统 是一种全功能、双激光、六探 测器的流式 细 胞 仪 分析系 统 ， C6流式 细 胞 仪 系 统 的探测 器不但可灵敏的捕 获 前散射光和旁散射光， 还 有四个可 调 光学 滤 光片的 荧 光探 测 器。 CFlow操作 软 件使搜集数据和分析 变 的 简单 快速。高集成度、高度自 动化的主机，以及 优 良人机界面、操作 简 便的 CFlow软件系 统 高通量平行合成仪高通量平行合成仪液相芯片检测仪微孔过滤板12通道药物筛选仪国家新药筛选中心条形 码 技 术条形 码 (barcode)是将 宽 度不等的多个黑条和空白，按照一定的 编码规则 排列，用以表达一 组 信息的 图 形 标识 符。常 见 的条形 码 是由反射率相差很大的黑条（ 简 称条）和白条（ 简 称空）排成的平行 线图 案。条形 码 可以标 出物品的生 产 国、制造厂家、商品名称、生 产 日期、图书 分 类 号、 邮 件起止地点、 类别 、日期等 许 多信息，因而在商品流通、 图书 管理、 邮 政管理、 银 行系 统 等 许多 领 域都得到了广泛的 应 用。 数据分析系 统l SAS（ Statistical Analysis System， 统计 分析系统 ）是当今国 际 最著名的数据分析 软 件系 统 。l SAS： 数据的 输 入 输 出和整理、描述性 统计 、假设检验 、 图 形的制作、回 归 分析、多元 统计 分析、方差分析、 协 方差分析和 时间 序列分析等 。l 数据 访问 ，数据管理，数据呈 现 ，数据分析l SPSSl EXCEL二、高通量 筛选 技 术 常用方法l 微孔板的使用和光学 检测 法l 工程菌株的裂解l 报 告基因l 流式 细 胞技 术l 蛋白 质 芯片微孔板的使用和光学 检测 法l 化学 发 光指化学反 应过 程中 发 射出来的光，又称冷光；l 生物 发 光是化学 发 光的一种， 专 指由 酶 催化的化学反 应过 程中 发 射出的光。l 化学和生物 发 光 经 常被用于 测 定 样 品中未知成分的量，并且在 过 去的十年里在基因表达和基因 调控的研究中 发挥 着非常重要的作用。 l 通 过发 射光的比率可以推出未知成分的 浓 度，因此 测 定化学反 应过 程中的 发 射光是非常有用的。反 应过 程中 产 生的光与 发 射光的量 产 率是直接相关的，相 应 的，与 发 光物 质 的 浓 度成比例。l 因此，反 应过 程中的光可以相 对 反映出目 标样 品中 发 光物 质 的量。化学 发 光 仪 使用范 围l ATP（三磷酸腺 甙 ） 检验 、 荧 光素 酶 检验 l 免疫及 proteomics l 核酸， DNA及基因 组 l 病毒研究（比如： SARS、禽流感病毒研究）l 临 床 诊 断研究 l 染色体分析 l 毒性 试验 l 细 胞活力 试验 l 餐 馆卫 生 检测l 环 境 检测l 工 业 、 农 林 业 、畜牧 业 、养殖 业 等其它用途l 最广泛的用途是 对 利用 报 告基因 检测 目 标 基因的表达以及检测细 胞内 ATP 水平。 报 告基因 实验 l 分子生物学家和 细 胞生物学家利用 报 告基因研究基因的表达和 调 控。l 将 报 告基因引入 细 胞 DNA 使之与某一特定分子事件相关，可以 为这 一分子事件 带 来可 测 性。通常检测 的分子事件是基因功能，具有可 测 性的是 发光。l 目前，市 场 上有 许 多 发 光 报 告基因出售。包括：萤 火虫 荧 光素 酶 （ firefly luciferase ）， 半乳糖苷 酶 （ B -galactosidase ）， 葡萄糖苷酸 酶（ B -glucuronidase ， GUS ），碱性磷酸 酶 （ alkaline phosphatase ），和人生 长 激素（ human growth hormone ， hGH ）。 l 高灵敏度，低成本，快速以及使用 简单 使得 发 光检测仪 成 为 理想的基因表达研究工具。 ATP 水平 测 定 l 所有活 细 胞都含有 ATP 。 ATP 可以从 细 胞中提取出来，用 萤 火虫 荧 光素 酶 检测 。在 这 个 发 光反 应 中， ATP 是限制性反 应 物。l 因此，到达 发 光 检测仪 光 电 倍增管的光与 样 品中 ATP 的含量成比例，相 应 的与提取 ATP 所用的 细 胞数成比例。 ATP发 光 检测 方法已 经 使用了几十年。 微生物 污 染 检测l ATP的 发 光 检测 方法可以 检测样 品中的所有微生物，因而被用于 检测 水中的大 肠 杆菌含量，包括 饮