荧光原位杂交ppt课件

L/O/G/O荧荧 光原位光原位 杂杂 交交 （ FISH） Fluorescence in situ hybridization以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链 DNA变性后杂交，互补的异源单链 DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源双链 DNA，通过荧光标记显示出来，通过荧光显微镜观察杂交信号。 FISH原理FISH发 展 1969年，同位素 标记 的 DNA探 针 ； 1974年，染色体 显带 技 术与 原位 杂 交 结 合； 1981年， 荧 光素 标记 的 cDNA探 针 ； 90年代后，多色探 针 出 现 。探 针 的 发 展放射性 标记 ：很 难满 足灵敏度和分辨率 这 两个原位 杂 交成功的条件，灵敏度要求放射性 标记 具有高中 辐 射能（ P32），档标记 物能量 过 高 时 ，会因 为 信号散射 导 致分辨率 过 低；如果使用低 辐 射能的放射性 标记 物（ 3H）可以得到 较 高分辨率，但由于灵敏度低而需要 长时间 曝光，并由此 导 致北京 过 高而难 以分辨出真正信号。非放射性 标记 ：常用的有 生物素 与荧 光素。生物素一般通 过连 接到 dUTP 等核 苷 三磷酸上， 这种经 修 饰 的核 苷 三磷酸再通 过 酶促反 应掺 入到探 针 中； 荧 光素核苷三磷酸可在 DNA聚合 酶 作用下 掺 入到探 针 中去，常用的 荧 光素有异硫 氰 酸 荧 光素（ FITC）、 羧 基 荧 光素（ FAM）、四 氯 -6-羧 基 荧 光素（TET）、 吲哚 二 羧氰 （ Cy3， Cy5）等探 针 制 备所 谓 核酸探 针 即是指一段用放射性核素或其他 标记 物（如酶 与荧 光素等） 标记 的 与 目的基因互 补 的 DNA 片段或 单链 DNA 或 RNA。根据其来 源可分 为 “cDNA探 针 、基因 组 探 针 、寡核 苷 酸探 针与 RNA 探 针 ”。 1.“cDNA探 针 ” 以 mRNA 为 模板 在逆 转录酶的催化下合成一 条与 mRNA 互 补 的 DNA链 （cDNA） 用 碱 除去 mRNA2.“基因 组 探 针 ”是把染色体 DNA通 过 超 声击断 或以限制性 内 切酶不完全水解 获 得 许 多染色体DNA随 机片段 择长 度 约 15-20kb（千 对碱 基）的 DNA片段重 组 到 噬菌体中 经 体外包装转 染大 肠 杆菌 筛选 出含目的基因的大 肠 杆菌 扩 增后提取 质 粒 酶切分离目的基因。 3.“寡核 苷 酸探 针 ”为 人工合成的 DNA片段，一般 长约 20-50个 bp（ 碱 基）。可根据已知DNA或 RNA序列合成精确互 补 的 DNA探 针 ；如不知核酸序列，可依据其蛋白 产 物的 氨 基酸顺 序推 导 出核酸序列合成 DNA探 针 。由于DNA自 动 合成 仪 的出 现 使探 针 的合成十分方便。 4.“RNA探 针 ”制 备 的技 术 路 线为 ： 将 一段含完整或部分基因的 DNA片段 插 入重 组质 粒的多克隆位点 以 内 切酶在 插 入片段中某一适 当部位或在 插 入片段下游的某一部位消化重 组质粒 使之成 为线 性 DNA 在相 应 的 DNA依 赖 性 RNA聚合酶催化下，以含目的基因的DNA片段 为 模板合成 RNA探 针 。由于 RNA探针为单链 ， 杂 交 时 不存在第二 条链 的 竞争 ，所以其敏感性 较经 缺口平移 标记 的 DNA探 针要高。 探 针 的非放射性 标记间 接 标记 ： 是采用生物素 标记 DNA探 针 ，杂 交 后再用 联 有 荧 光素的抗生物素抗体 检测 。 （可将 检测 信号放大， 监测到小至 00 b的靶序列）直接 标记 ： 是通 过荧 光素直接与探 针 核苷酸或 磷酸戊糖骨架共价 结 合，或在 缺口平移法 标记 探 针时掺 入 荧 光素核苷三磷酸 标记 探 针 。 （ 检测 步 骤简单 ，但不能将信号放大，不如 间 接 标记 的探 针 灵敏）切口平移法：切口平移 标记 法先由胰 DNA酶 I在 DNA双 链 上随机切口，大 肠 杆菌 DNA聚合 酶 I 作用以切口 处 开始，以另一条 DNA链为 模板，以 4种三磷酸脱氧核苷酸 为 原料，沿切口水解 5端核苷酸和 3端修复加入 标记 核苷酸同 时进 行，切口平行推移，可均一 标记 DNA链 。（引物延伸法）本法与切口平移法相似，都是利用 DNA聚合 酶 来合成与模板互补 的新的 DNA链 。由于 DNA聚合必 须 从具有 3-OH的末端开始合成，因此与切口平移不同，引物延伸法需要一段与模序列互补 的寡聚核苷酸作引物，将它与模板 杂 交，以提供 3-OH端。探 针类 型1、染色体单一序列探针，包括各类人工染色体探针，如酵母人工染色体、细菌人工染色体， 主要用以识别染色体的易位、缺失和扩增。2、染色体涂染探针，包括通过流式分选或显微切割获得的全染色体或染色体臂以及特异性区带的涂染探针， 用以检测染色体数目或结构异常。3、染色体重复序列探针，主要是指着 丝粒 - 卫星 DNA 重复序列探针 和端粒重复序列探针，用以检测染色体数目异常 。 染色体涂染探 针 ：判 断 易位染色体8号染色体探 针-卫 星 DNA是唯一一个存在于所有人 类 染色体着 丝 粒区域的着丝 粒 DNA（ centromere DNA， CEN-DNA）家族，由 171bp的 单 体 为单 位组 成的高度串 联 重复片段，重复数百次至数千次，跨越 长 达 100kb的着丝 粒 DNA区域，其 杂 交将 产 生很 强 的 杂 交信号。因此常被 选为 着 丝 粒探 针 的来源。 FISH技 术 的 优 点FISH技 术 作 为 非放射性 检测 体系，具有以下 优 点：1、 荧 光 试剂 和探 针经济 、安全；2、探 针稳 定，一次 标记 后可在两年内使用；3、 实验 周期短、能迅速得到 结 果、特异性好、定位准确；4、 FISH可定位 长 度在 1kb的 DNA序列，其灵敏度与放射性探针 相当；5、多色 FISH通 过 在同一个核中 显 示不同的 颜 色可同 时检测 多种序列；6、既可以在玻片上 显 示中期染色体数量或 结 构的 变 化，也可以在 悬 液中 显 示 间 期染色体 DNA的 结 构。Applications of FISH基因 组结 构研究；染色体精 细结 构 变 异分析；病毒感染分析 ；人 类产 前 诊 断；肿 瘤 遗传 学；