毛细管电泳原理及分析策略

毛细管电泳分离原理及分析策略 贝克曼高效毛细管电泳仪 毛细管电泳是带电 粒子在电场力的驱 动下，在毛细管中 按其淌度或和分配 系数不同进行高效 、快速分离的电泳 新技术，也称为高 效毛细管电泳 (Capillary Electrophoresis, CE)。 毛细管电泳的原理 1 装置 毛细管 数据处理 电极 检测器 电极 试样 缓冲液 高压电源 （可高至 30KV） 2 电 泳和 电 渗 电 泳 是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动 的现象。 电 渗 是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体 沿固体表面移动的现象。 2 电 泳和 电 渗 电 泳 行 为 与特性使用淌度描述 即单位场强 (E)下离子的 平均电泳速度 ep=/E 实验 中，只 发 生 电 泳 时 有效淌度 ef =ef (L /V) =( l / tm ) (L /V) 毛 细 管有效 长 度 迁移时间 毛细管总长度 电压 2 电 泳和 电 渗 电 渗 与固液界面的双 电层 有着密切的关系 在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛细管壁 的负电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子鞘，在电场作用 下，溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧密层作相对运动， 携带着溶剂一起向阴极迁移，便形成了电渗流（ electroosmotic flow ,EOF）。 固液两相间的 总电势 -热力学 电势 -0 Zeta电势 - 2 电 泳和 电 渗 电 渗流的流型特点 电渗流 HPLC 塞流 层流 2 电 泳和 电 渗 电 渗流的表示 电 渗流的大小可用淌度 (eo)或 电 渗流系数表示 eo =eo / E = l /( teo E ) 电渗流速度 毛细管有效长度 电渗流流出时间 电场强度 第 22章 毛 细 管 电 泳 22 1 毛 细 管 电 泳的原理 2 电 泳和 电 渗 电 渗流的意 义 n电泳过程中，伴随着电渗现象 n电渗流的速度比电泳速度快 5 7倍 n利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向， 产生差速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的 分离分析 电渗流是毛细管电泳分离的重要参数 控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分 离的效率、重现性、分离度。 分情况而论 2 电 泳和 电 渗 改 变电 渗流的方法 n改变外加径向电场 n改变缓冲液成分和浓度 Zeta电势 n改变缓冲液 pH n加入添加剂 n改变温度 粘度 盐 -离子强度 表面活性剂 eo正比于 Zeta电势和介质的 介电常数 反比于 介质的黏度 Zeta电势正比于 双电层厚度 和 界面有效电荷密度 反比于介质的 介电常数 表 观电 泳淌度 ap ap=ap/E ap为离子的表观迁移速度 ap=ef +eo ap= ef + eo 2 电 泳和 电 渗 3 分离效率和分离度 分离效率 柱效可以用理 论 塔板数 n表示 n = (ep+eo) V l /(2DL) 毛细管电泳分离的柱效方程 理 论 塔板高 H =L / n n = 5.54(/ W)2 实验 上可按上式求出理 论 塔板数 为电泳图上从 起点 至电泳 峰最大值 之间的距离 W为电泳峰的 半高峰宽 3 分离效率和分离度 分离度 电 泳中两峰的分离度（ Rs）， 也称 为 分辨率，它表 示了淌度相近的 组 分 分开的能力，可表达 为 Rs= （ n 1/2/4） （ /平 ） 相邻两区带的迁移速度差 平 为两者的平均速度 / 平 表示分离选择性 n为柱效 分离度 计 算式 Rs = 2 (tm2 - tm1 ) / ( W1 + W2 ) tm1、 tm2 分别为两个组份的迁移时间 W 为 峰底的宽度 3 分离效率和分离度 4 区 带宽 度及其展 宽 因素 区 带宽 度 展 宽 因素 n焦耳 热 n进样 n电 泳 扩 散 n毛 细 管壁 对组 分的吸附 焦耳 热 细内径（ 10以后，电渗流基本不增 加 添加剂：有机溶剂可以降低电渗流的大小， 从而增加分离的有效距离；表面活性剂可以 彻底改变电渗流的方向和大小，主要是在阴 离子分析时使用 缓冲溶液的影响和选择 在 CE中应该根据以下性质来选择缓冲溶液： 在所选的 pH范围内有较强缓冲能力； 在检测波长处有低的紫外吸收； 小的淌度（即大体积、低电荷离子）以降低所产生的 电流。 那些被称为生物 “优良缓冲液 ”的，如 Tris, borate, CAPS等特别有用，因为这些缓冲溶液中的离子一般 较大，能够在较高浓度下使用而不会产生大的电流， 但一个潜在的缺点是这些大的缓冲离子有强的紫外吸 收。 常用的 CE缓冲体系 磷酸钠体系 宽缓冲范围 硼酸钠体系 高 pH范围 Tris-HCl体系 低 pH范围 醋酸 -醋酸铵体系 CE/MS常用体系 CZE分离条件的选择 毛细管类型 -涂层还是非涂层？ 毛细管长度 -长毛细管还是短毛细管？ 缓冲液体系 -种类和 pH值 添加剂类型 -甲醇 |环糊精 |乙腈 检测器选择 -紫外 |二极管阵列 |激光诱导荧光 缓冲溶液的选择 可先用磷酸缓冲体系为搜寻基础，初步确定 （最佳） pH范围后，再进一步细选出更好 pH 和缓冲试剂。磷酸盐是毛细管电泳中最常用 的缓冲体系之一，它的紫外吸收低， pH缓冲 范围比较宽（ pH=1.5 13），但电导也比较 大。 缓冲溶液及 pH值的选择 研究经验表明：对于蛋白质、肽和氨基酸等 两性样品，采用酸性（ pH 2）或碱性（ pH 9）分离条件，比较容易得到好的分离结果； 糖类样品通常在 pH=9 11之间能获得最佳分 离；羧酸或其他样品多在 pH=5 9之间选择 分离条件 。 缓冲溶液及 pH值的选择 pH 的选择也和所用的毛细管种类有关，许多 涂层毛细管只能在一定的 pH范围内工作，例 如聚丙烯酰胺涂层毛细管，在 3 pH 8的范 围以外工作，其涂层容易水解失效。 缓冲溶液及 pH值的选择 在相同的 pH下，不同缓冲体系的分离效果不 尽相同，有的可能相差甚远。一般的经验是 ，能与样品发生相互作用的试剂，有可能就 是最好的试剂。一个典型的例子是，在分离 糖类和 DNA等分子时优先使用硼酸盐缓冲体 系，因为硼酸根能与糖羟基形成配位键，从 而增加糖的负电荷和分离度。硼酸缓冲试剂 也适用于其他含邻位羟基或多羟基化合物的 分离。 缓冲溶液及 pH值的选择 缓冲试剂及 pH调节剂的浓度也需要优化。缓 冲试剂的浓度一般控制在 10 200 mmol/L之 间。电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼砂等 ，其浓度多控制在 20 mmol/L附近，而电导小 的试剂如硼酸及 HEPES等，其浓度可在 100 mmol/L以上。有时为了抑制蛋白质吸附等特 殊目的，可采用很高（ 0.5mol/L）的试剂 浓度，此时要注意减少分离电压，分析速度 自然也将随之降低。 添加剂的选择 目的： 改善分离 抑制分析物在毛细管上的吸附 添加剂的选择 甲醇 |乙腈（ 5-50%） 降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果 增加非极性物质的水溶性 环糊精 |SDS等表面活性剂 增加分离选择性，提高分析效果 降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果 非极性高分子聚合物 掩蔽毛细管内壁电荷，抑制分子吸附 降低电渗流 形成一定的分子筛，提高分子大小选择性 第二章 毛细管胶束电动色谱 电解质 中加入 表 面活性 剂 (surfactant， 例如 SDS)， 使 之 形成 胶束（ Micelle） ， 样 品根 据 其 疏水性 (Hydrophobicity)强弱的 差 异， 在 胶 束与电解质的 分配系 数 有所不同來 进 行分 离 ，样品 疏水性愈強 ，则进 入 胶束 的 机会 愈大 。 通常 物质进 入 胶束后， 泳 动 的速度 会变 慢 ， 因此疏水性愈強的物 质则 愈慢出來。 毛细管胶束电动色谱原理 SDS -+ EOF Micellar Electrokinetic Chromatography (MEKC) 七种青霉素的分离 (A) CZE : 20mM Pi-Borate, pH 8.5 (B) MEKC : 0.1 M SDS in (A) soln. 胶束电动色谱的特点 优点 增加对弱极性物质分离 的分离度 在中药分析、天然产物 分析、农药分析中经常 使用 缺点 稳定性不佳，达到好的 重复性比较困难 第三章 毛细管凝胶电泳 毛細管內先填充 凝胶 (例如 polyacrylamide或 cellulose)， 此 时凝胶会 在毛細管內形成分子 筛，样 品依分子量 的 大小在毛細管內移 动 速 度不同而 进 行分 离。 主要用于核酸片断及蛋白分子量分析 毛细管凝胶电泳 CE双链及单链核酸分析 45-寡核苷酸质控 1.0 2.0 3.0 12 3 45 6 7 8 9 1011 12 13 14 15 16 17 18 1 9 2 0 23 24 252627 28 2930 30 31 32 33 34 IS 21 10.0 15.0 Relative Fluorescence Intensity dsDNA片段 (72 bp-12 Kbp) CE-SDS蛋白分子量分析 第四章 毛细管等电聚焦 第五章 亲和毛细管电泳 -分离条件基于 CZE 当在 CZE样品或缓冲液中引入抗原或抗体时 ，便可以用于研究和分析抗体或抗原，也可 以利用这种方法对电泳峰进行特异性定性。 显然除抗原与抗体的选择需要应用生化知识 外，其他方面的选择与 CZE等相同。 用于研究 分子间相互作用测定，分子构型变化 特定物质检测 活性物质筛选 ACE测定分子间结合常数与解离速率 JAK2与 SH2-B之间的相互作用研究 CE药物筛选 ACE用于相互作用筛选 适体 Aptamer类似于 抗体，但可以体外 合成，结合常数比 抗体更高，有广泛 的药物筛选和临床 诊断应用潜力 目前已有以下的一 些蛋白的 aptamer是 采用 CE方法筛选得 到的 1. IgE 2. HIV type 1 reverse transcriptase 3. Thrombin 4. Anti-thrombin III 5. Taq DNA polymerase ACE用于相互作用筛选 传统筛选方法如亲和 色谱或者 CEC筛选一 个 Aptamer需要 4-6 周 而 CE只需要几天就 可以了，大大提高了 筛选速度 -MicroScale Bioseparations 2006 第六章 检测器选择 小分子检测 大分子检测 CE检测器种类及性能 小分子检测 有紫外吸收 首先选择二极管阵列检测器或紫外检测器 无紫外吸收 可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外检 测器检测，如氨基酸、还原性糖等 不可以衍生化的，可采用间接紫外法用紫外检测器检 测，也可以尝试电化学检测器 有荧光或需要高灵敏度检测的可采用 LIF检测器 需要测定结构或者难以用光学检测器检测的，可以考 虑质谱检测 大分子检测 蛋白、核酸 可以首先选择紫外检测器 如果需要高灵敏度检测可以采用柱前或者柱上衍生的 方法标记荧光，然后用 LIF检测 如果需要特异性检测，可使用特异性荧光探针，标记 后再 LIF检测 需要测定分子量或氨基酸序列，可采用质谱检测 多糖 含量较高的多糖可以采用末端吸收法以紫外检测器检 测 含量较低的还原性多糖可用衍生试剂标记后以 LIF、 UV的方式检测 第七章 分离条件选择流程 分离条件的选择是毛细管电泳中最重要但也是最难之 处。不同的专业研究工作者可能会有各自不同的选择策略 和流程，我们提出如下九步选择流程，仅供参考： 第一步，尽可能多地了解分离样品的类型、来源、组成 及其性质； 第二步，根据样品的可能性质和来源，选择分离模式， 若无样品信息可先选 CZE； 条件选择流程 第三步，根据样品性质确定检测方法，一般先选直接 紫外吸收； 第四步，确定样品处理方式，包括衍生方案以及离心 过滤除蛋白等； 第五步，根据样品解离常数计算最佳 pH， 或利用 75mID毛细管和磷酸缓冲体系确定 pH范围 ; 条件选择流程 第六步，根据所需 pH构建缓冲体系，包括进一步优化 pH 、 缓冲试剂浓度等； 第七步，优化其他操作参数，如毛细管尺寸、分离电压和 温度等； 第八步，确定是否需要使用添加剂和使用非水溶剂； 第九步，确定是否需要换用其他分离模式。 条件选择流程 在毛细管电泳条件选择中，还应充分注意下列操作事项 ： 最好对样品和缓冲液进行过滤或离心处理。 毛细管的洗涤或平衡，与缓冲体系、 pH以及柱子有关 。磷酸根与石英和玻璃之间存在慢相互作用，需要延长平衡 或冲洗时间，处理的时间应由分离重现性决定。 条件选择流程 欲降低缓冲液的电导，应尽量使用所谓的 “生物缓冲 试剂 ”；欲降低检测背景，则应尽量使用无机缓冲试剂。 欲保持分离重现，要尽量采用相同的条件，包括毛 细管、缓冲液、温度、电压、洗涤等。 第八章 各类物质的分离要点 阴离子及有机酸 此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法 间接紫外法一般以铬酸钠等物质作为背景吸 收物 CTAB通常用作电渗流反向剂，以加速出峰， 提高峰的尖锐度 要使用反向极性分离 各类物质的分离要点 阳离子及金属离子的分离 此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法 间接紫外法一般以氨基吡啶等物质作为背景 吸收物 与阴离子不同的是阳离子的分析不需要在缓 冲溶液中添加电渗流反向试剂 也不需要使用反向极性分离 各类物质的分离要点 易电离有极性的化合物 一般采用长 60cm的毛细管 分离的最佳 pH在分析物 pKa+/-1左右 通常不需要添加剂 各类物质的分离要点 弱极性物质和水溶性差的物质（一些中药成 分