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高效抗肿瘤抗生素 calicheamicin 的发酵和分离纯化研究 陈华 1,2*，郑玲辉 1，姜璐琰 1，王继栋 1，王玲萍 1，白骅 1 (1. 浙江海正药业股份有限公司中研院微生物研究所, 浙江台州 318000; 2. 浙江省抗真菌 药物研究重点实验室, 浙江台州 318000) 摘要：目的 从一株产抗肿瘤抗生素 calicheamicin (CLM)原始菌种出发，旨在提高发酵单 位和建立分离纯化 CLM 的工艺。方法 通过微波、NTG 等物理化学方法选育 CLM 高产突 变菌种，利用有机溶剂萃取、硅胶分离、制备 HPLC 精制等方法分离纯化 CLM。结果 从 原始菌种 Micromonospora echinospora ssp. Calichensis 出发选育出 CLM 高产菌种，发酵单 位达到 50 gmL-1，并分离出目标活性组分 CLM 1I。结论 通过提高发酵单位和建立分离 提取工艺路线，为该产品的产业化开发打好了基础。 关键词：Calicheamicin; 高产菌种; 分离纯化 中图分类号： 文献标识码：A 文章编号： Fermentation and Purification of a High Active Antitumor Antibiotic Calicheamicin CHEN Hua1,2*, ZHENG Lin-hui1, JIANG Lu-yan1, WANG Ji-dong1, WANG Lin-ping1, BAI Hua1 (1. The R 2. Zhejiang Key Laboratory of Antifungal Drugs, Taizhou 318000, China) ABSTRACT: OBJECTIVE The aims of this study were to improve the production of calicheamicin (CLM) and to purify the antitumor antibiotic. METHODS The microwave and NTG were applied as mutagenic source for breeding high-yielding mutant strain. The isolation procedures of organic solvent extraction, silica gel chromatography, and preparative HPLC were used to purify CLM 1I. RESULTS A high-yielding mutant strain with CLM production of 50 gmL-1 was screening out. The purified CLM 1I was obtained after the isolation steps. CONCLUSION The production of CLM 1I was improved and the purification steps were established. The results of this study were useful for further industrialization of this product. KEY WORDS: Calicheamicin; high-yielding strain; purification 收稿日期： 基金项目：浙江省抗真菌药物研究重点实验室项目 *通讯作者：陈华（1980-），男，安徽绩溪人，博士，主要从事微生物药物研究。E-mail ： 2 恶性肿瘤是威胁人类健康的最严重疾病。长期以来，肿瘤治疗一直都是医学界研究的 一大课题，寻找治疗肿瘤的新药更是药物研究人员的首要任务。很多抗肿瘤药物都是由微 生物代谢产生的，如doxorubicin, geldanamycin, epothilone B, bleomycin 等。其中烯二炔类抗 肿瘤抗生素calicheamicin (CLM)具有特殊的分子结构和作用机制，对多种肿瘤细胞均有强烈 的杀伤作用，是迄今发现的活性最强的一类抗肿瘤抗生素 1。由于CLM的毒性太大，不能 单独给药，所以目前该抗生素作为分子靶向药物 单克隆抗体的“弹头”进行开发 2-3。 其中以CLM 作为 “弹头”的靶向治疗药物GO (Gemtuzumab ozogamicin)已被FDA批准用于 治疗急性髓细胞白血病 4。 然而，CLM 由于发酵单位过低，文献报道不到10 gmL -1，而且存在多种同系物 5，对 其分离纯化和进一步开发带来很大难度。本文从一株产CLM原始菌种出发，从提高发酵单 位和建立分离提取工艺进行了研究，得出较好的结果。 1 材料 1.1 菌种 实验所用原始菌种912为棘孢小单孢菌变种Micromonospora echinospora ssp. Calichensis。高产菌种 912-36-2为该菌种经过微波、 NTG等多轮物理和化学诱变后筛选出的 高产突变菌种。 1.2 试剂及仪器 旋转蒸发仪: BCHI Rotavapor R-200加循环冷冻盐水。分析型HPLC ：Agilent 1200，色 谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18, 5m, 250 4.6 mm；制备型HPLC: Shimadu LC-8A, 色谱 柱：Shimadzu-C18, 5m, 250 20 mm。LC-MS 联用仪：Agilent 1200液相系统与Bruker micrOTOF-Q II 质谱系统联用。摇床：美国 NBS INNOVA-5000摇床系统。发酵罐：上海国 强50L发酵罐系统。乙酸乙酯、正己烷、甲醇均为国产分析纯试剂。乙腈为色谱纯试剂。 1.3 培养基 斜面、平板固体培养基：放线菌用ISP-2培养基(BD, Difico)。种子培养基：酵母抽提物 5 gL-1, 牛肉膏3 gL -1, 胰蛋白胨5 gL -1, 糊精24 gL -1, 葡萄糖5 gL -1, CaCO3 4 gL-1, pH 7.0. 发酵培养基：蔗糖20 gL -1, 糖蜜5 gL -1, 蛋白胨2 gL -1, CaCO3 2.5 gL-1, FeSO47H2O 0.1 gL- 1, MgSO47H2O 0.2 gL-1, KI 0.1 gL-1, pH 7.0。 2 方法 2.1 高产菌种的选育 3 原始菌种M. echinospora ssp. Calichensis CLM 的产量很低，难以达到产业化要求。实 验室通过微波诱变、NTG诱变等物理化学方法选育高产突变菌种。微波诱变：将单孢子悬 浮液置于灭菌10 ml试管中，置烧杯中冰浴，将冰浴烧杯连同试管放入800W 的微波炉中， 中档功率照射一定时间，稀释涂布平板，单菌体成熟后作摇瓶发酵效价测定，比较筛选高 产株；NTG 诱变：取现配制好的NTG母液与单孢子悬浮液混合于试管内，置28保温2 h后， 用过量无菌生理盐水洗涤3次，稀释涂布平板，其他方法同上。 2.2 CLM产生菌种的液体发酵 将200 mL种子培养基装入1000 mL三角瓶中，121C条件下灭菌20min，接种1 mL孢子 悬浮液( 孢子数约为110 8个) ，28C、250 rmin -1条件下培养48 h；以10%的接种量接入50 L 发酵罐中，发酵条件为温度28C、通气量1 vvm、搅拌浆转速 200 rmin-1，单批发酵周期为 10 d。 2.3 CLM粗提物的制备 将30 L发酵液用等体积的乙酸乙酯浸泡提取，将乙酸乙酯减压浓缩蒸干，加入 500 mL 正己烷搅拌除去溶解的脂类杂质，将不溶物溶解于乙酸乙酯，再加入过量无水NaSO 4干燥， 最后加入二乙醚正己烷沉淀，离心收集沉淀即得到CLM粗品。 2.4 CLM 1I的分离纯化 在CLM 类同系物中，目前用于临床的为CLM 1I。将CLM粗品与适量硅胶拌样上硅胶 柱，用乙酸乙酯甲醇梯度洗脱，当EtOAc 由100% 至EtOAc:MeOH (90:10, v/v)时将CLM洗 脱下来。将分段收集的含有CLM组分合并，用Shimadu LC-8A制备HPLC系统进一步纯化 1I 组分，洗脱剂为CH 3CN-0.2 M NH4OAc (45:55, v/v)，保留时间约为15 min左右收集洗脱峰， 减压浓缩并冷冻干燥即为 1I纯品。 2.5 CLM的液相检测条件 Agilent 1200液相系统和Agilent ZORBAX SB-C18 (5m, 250 mm 4.6 mm)色谱柱，流 动相为0.01 M 甲酸铵：95%乙腈45:55(v/v)，检测波长为230 nm ，洗脱流速为1.0 mlmin - 1，进样量为10 L。 3 结果 3.1 CLM高产菌种的选育 原始菌种由于产量太低，难以产业化。实验室通过微波诱变、NTG诱变等物理化学方 法选育出一株CLM高产菌种912-36-2，产量达到50 gmL -1，较原始菌种产量有了大幅度的 提高，达到产业化的要求。 3.2 发酵产生的CLM同系物分析 4 发酵液经EtOAc提取后，经过适当浓缩，进行 LC-MS分析，HPLC图谱如图1所示。对 每个液相洗脱峰进行MS联用分析，结果表明保留时间分别为13.66、17.70、19.21和25.14 min的HPLC峰为已报道过的CLM类化合物 5，分子量分别为1353、1321、1367和1381，如 图2所示。这4个CLM类化合物分别为CLM 1I, 1Br, 1I和 1I，归类见表1，其结构上的区别在 于侧链上的卤代物X和侧链R，结构图3所示。 图1 发酵液经乙酸乙酯萃取后的HPLC图谱 Fig. 1 HPLC separation of EtOAc extracted culture broth 图2 HPLC中CLM 类化合物的质谱图 注：a, b, c, d分别表示保留时间为13.6, 17.7, 19.2, 25.1 min的HPLC 峰的质谱 Fig. 2 HPLC-MS spectrum of CLMs Note: a, b, c, d represent MS spectrum of HPLC peaks with retention time of 13.6, 17.7, 19.2, 25.1 min, respectively. 5 表1 发酵过程中产生的CLM类化合物 Table 1 The detected CLMs in culture broth extraction Calicheamicin X R Mr Retention time (min) 1I I CH3 1353 13.64 1Br Br CH2CH3 1321 17.73 1I I CH2CH3 1367 19.24 1I I CH(CH3)2 1381 25.11 图 3 CLM 类化合物的结构式 Fig. 3 The structure of CLMs 3.3 CLM 1I组分的纯化 CLM粗提物中含有多个同类化合物，而用于临床的组分为 1I，故对用制备HPLC 对粗 品进一步纯化，收集 1I组分浓缩、冻干。该纯品溶于乙酸乙酯后，用分析型 HPLC检测，结 果如图4所示。由图可知，保留时间为19.5的峰LC/MS检测m/z 为1368.3(图5) ，为M+H +峰， 分子量为1367，说明该组分为 1I。 图4 纯化后CLM 1I组分的HPLC图谱 Fig. 4 HPLC spectrum of purified CLM 1I 6 图5 CLM 1I的质谱图 Fig. 5 MS spectrum of purified CLM 1I 4 讨论 目前，单克隆抗体CD33-CLM偶联物已经在美国作为一种药物用于治疗恶性肿瘤，且 多种单抗-CLM偶联物已申请临床研究 6-7，该类分子靶向药物应用前景广阔。由于该类化 合物毒性很高，在代谢过程中产物对菌体生长抑制很大，故菌种发酵CLM的产量很低，一 般仅为几个毫克每升，使得发酵、分离提取成本太高，制约了该产品的产业化开发。本项 目组的研究旨在提高CLM发酵单位和建立分离纯化工艺，通过提高发酵单位和建立分离提 取工艺路线，为该产品的开发打好了基础。 REFERENCES 1 Maiese WM, Lechevauer M P, Lechevalier H A, Korshalla J, Kuck N, Fantini A, Wildey M J, Thomas J and Greenstein M. 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