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摘 要 目的：人参蛋白及多肽主要具有抗脂质分解、抗血红细胞聚积、抗真菌、抗 病毒、精氨酸酶活性等。选择研究较少但活性多样的大分子人参蛋白及多肽， 通过现代分离纯化技术、活性检测技术及分析鉴定技术进行生物特性研究。通过 对不同参之间的蛋白成分进行比较和研究，对人参的一些多肽成分的分析和应用 提供依据。 方法：采用中药化学及生物化学提取法,结合离子交换、凝胶过滤层析和反相 C18 层析等现代生物分离技术, 利用膜分离技术及柱层析技术对总蛋白进行分离纯 化，结合细胞活性实验进行活性筛选，对人参中的蛋白及多肽进行了分离纯化， 采用 HPLC、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（ SDS-PAGE）及凝胶电泳图像分析软 件等谱学技术，初步研究了这些蛋白多肤的结构,并从细胞水平进行了体外活性实 验,探讨蛋白与多肤的生物活性。 结果：采用现代生物层析分离技术从人参中分离纯化得到 3 个蛋白质单体化 合物,分别为 GSP、GSP及 GSP。经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱人 参蛋白及多肽药理活性实验表明, 人参蛋白 GSPll 对金黄色葡萄球菌具有抑制作用; 对 Hep-2 细胞具有抑制作用，对 3T3 细胞具有增殖作用，且活性呈现一定量效关 系。 关键词 人参 多肽 提取工艺 活性研究 II ABSTRACT Objective:Ginseng proteins and polypeptide, which have a variety of biological activities but less reasearches, were studied by modern technologies including isolation and purification technology, activity detection technology and analysis - identification technology. Providing a basis for identification and quality evaluation among ginseng, wild ginseng and American ginseng by showing a comparative study of their water- soluble protein components. Methods: Using different buffer, different ratio of solution, different extraction time to extract the ginseng protein, using Bradford method, determin the rate of protein extraction for the evaluation Standards, choose the best optimized extraction process. Purification was carried by hollow fiber system and column chromatography technology, combined with cell activity to screening activity component. Compare the difference of the proteins among ginseng, wild ginseng and American ginsengusing SDS- polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and image analysis software. Results: Three proteins were obtained from Ginseng：GSP、GSPand GSP。activity experiments show that it have inhibitory effect on 3T3 cells proliferation and have inhibitory effect on Hep-2 cells proliferation, Key words Ginseng Polypeptide Extraction ProcessPropert 长春工业大学人文信息学院学士学位论文 I 目 录 第一章 文献综述 .1 1.1 人参的发展趋势及待解决问题 .1 1.2 人参蛋白的研究现状 .2 1.3 蛋白质及多肽在中药鉴别中的重要地位 .4 1.4 本课题研究的内容及意义 .4 第二章 材料与仪器 6 2.1 材料与试剂 .6 2.1.1 原料 .6 2.1.2 其它材料与试剂 .6 2.2 仪器 .7 第三章 实验方法 8 3.1 人参多肽的分离纯化 .8 3.1.1 人参多肽的提取制备 .8 3.1.2 人参多肽的纯化 .8 3.1.3 高效凝胶过滤色谱（HPGFC）检测 .8 3.1.4 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测 8 3.2 人参多肽的活性研究 .9 3.2.1 细胞系 9 3.2.2 试剂配制 9 3.2.3 传代细胞培养 .10 3.2.4 样品配制 .10 3.2.5 MTT 法检测人参多肽对细胞增殖的影响 10 II 第四章 实验结果 .12 4.1. 人参多肽的分离纯化 12 4.1.1 人参多肽的提取制备 .12 4.1.2 人参多肽的 SEPHADEX G-75 层析图谱 .12 4.1.3 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 .13 4.1.4 高效凝胶过滤色谱检测 .13 4.1.5 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测 .14 4.2 人参多肽的活性研究 .15 4.2.1 人参多肽对 3T3 细胞增殖影响 .15 4.2.2 人参多肽对 2BS 细胞增殖影响 .16 4.2.3 对 HEP-2 细胞增殖影响 17 第五章 讨 论 .18 5.1 人参多肽的分离纯化 18 5.2 人参多肽的活性研究 19 致 谢 .21 参 考 文 献 22 长春工业大学人文信息学院学士学位论文 1 第一章 文献综述 人参在我国医药史上具有极其特殊的地位，被誉为“百草之王” ，是吉林省 乃至全国的标志性中药材。人参在我国中药中用途非常广泛，在中国药典、中国 国家部颁标准中出现的次数均排在第一位。现代医学研究证明，人参对中枢神经 系统、心脑血管系统、呼吸系统、血液及造血系统、内分泌系统及生殖系统都具 有良好的保护作用。另外，研究证明，人参还具有明显的抗肿瘤、抗辐射、抗衰 老和解毒功能。由于人参的卓越滋补强壮作用和独特的医疗功效，因此吸引了许 多化学家致力于有效成分之分离和鉴定。由于化学分析方法的进步，近三十余年 来，人参成分的分离、提纯和结构鉴定得到了重大的进展，迄今已知人参根中含 有人参皂苷、多糖、挥发油、脂肪酸、甾醇、维生素、蛋白质、多肽等多种有效 成分 1,2。但目前人们的研究主要集中于人参皂苷及挥发性成分研究，蛋白质及多 肽的研究相对较少。 中药所含化学成分非常复杂。目前，对这些成分的研究往往集中于糖、生物 碱、苷类、挥发油等。而另一些在中药里普遍存在的成分，尤其是蛋白质等生物 大分子研究相对薄弱。蛋白质作为一类重要的高分子化合物，存在于所有动物和 植物的各种组织、细胞中，是生命存在的主要物质基础。中药蛋白质不仅与中药 的医疗作用有着密切的关系，而且对于鉴定中药的品种、质量以及加工炮制等都 有重要意义。 1.1 人参的发展趋势及待解决问题 目前人参的加工产品主要为红参,其加工方法为人参先蒸至熟,再加热烘干制 成红参,外观上参体变得致密、角质、透明,颜色也由鲜参的黄白色变成棕褐色。 据报道在红参的加工过程中人参总皂普含量损失近 32%,而生物大分子如蛋白质及 多肽在加工过程中是否变性,结构如何变化,没有类似这些问题的研究报道。生物 大分子活性变化是人参加工工艺的重要参数,对于阐明人参产品药用机理具有重要 意义。从上述文献可以看出,人参在药用研究方面多从皂普考虑,生物大分子特别 是多肽是作用及机理涉及太少,虽然近年从人参中分离蛋白质及多肽的工作正在兴 起,但对于人参中所含的 300 种多肽与蛋白来说,这只是一个开始。因此,运用现代 2 生物技术从人参中分离出具有生物活性的多肽及蛋白质,并利用活性和结构两种方 法研究其活性及结构变化规律,通过这些数据利用生物工程技术,为开发出高活性 的生物药奠定基础。 长期以来，人们对人参皂甙和挥发油的研究较多。而对于一些水溶性活性成 分如人参蛋白及多肽的研究却较少。目前的研究表明，人参蛋白及多肽主要具有 抗脂质分解、抗血红细胞聚积、抗真菌、抗病毒、精氨酸酶活性等。此外，在人 参蛋白研究中，也存在一些问题。一方面，偏重小分子蛋白即多肽的研究，对含 量较高的大分子蛋白重视不够，对人参多肽的报道要远远多于人参大分子量蛋白。 其原因之一，就是许多研究人员认为多肽是药材的活性成分或有效成分，而大分 子量蛋白应是结构蛋白或储存蛋白，并没有与药材相应的显著的临床疗效。这就 造成了研究大多以开发新药为目的，偏重药效或活性研究，对大分子蛋白在中药 炮制加工和质量控制方面的作用重视不够。另一方面，技术水平较低，研究不能 深入。关于人参蛋白的研究工作许多为 1020 年前报道的，由于技术水平的限制， 导致产品收率较低、纯度不高以及耗时较长，没有形成一个同时纯化多种蛋白的 快速、高效纯化工艺路线，并且没有关于人参蛋白及多肽库这一领域的理论研究。 1.2 人参蛋白的研究现状 人参蛋白及多肽的研究始于六十年代, 主要集中于人参多肽的提取方法。 1963 年，德国的 F.Gstirnor 等人首次从人参根中检测出氨基酸：谷氨酸、半胱 氨酸、酪氨酸 3。1966 年他们又采用电泳的方法从高丽白参的甲醇水提取液中得 到 5 个小肽， 未确定出一级结构 4。1980 年，日本人 Ando 与 Okada 等发现人参 水提取液中有一种强烈抑制肾上腺素诱导的脂肪分解的物质 5，此物质能被链霉 蛋白酶（pronase）破坏,估计为蛋白或肽类化合物。经 DEAE- Cellulose,SephadexG-10,Avicel-Cellulose,PhosphoricCellulose 等色谱手段 分得一个 14 肽，氨基酸组成为 2Asp，Thr，Ser，3Glu，3Gly，Ala，Val，Leu, Il,未测出一级结构,之后也未查到继续研究此肽的报道。 1990 年 Takaku 和 Okada 等又报道从高丽红参中得到一种酸性物质 6，可以抑制肾上腺素诱导的脂肪 分解并能刺激胰岛素参与的脂肪合成，并确定该酸性物质为焦谷氨酸。同时他们 还指出红参中可能有一种非肽物质也有此活性。在此期间，韩国的 Kim 等报道从 长春工业大学人文信息学院学士学位论文 3 人参中分离纯化到有抗脂肪分解活性的寡肽 7，但未给出一级结构。Yagi 等人 1994 年从人参中提取到一种四肽成分:Val -D-Glu-D-Arg-Gly。并证明一些非蛋 白氨基酸对其调节神经系统活性至关重要。魏俊杰等人 8从生晒参中分离出两种 人参多肽，分别是分子量为 1000Da 的 11 肽和分子量为 1300Da 的 12 肽，它们具 有降低 2BS 细胞内多糖含量和增强 2BS 细胞内琥珀酸脱氢酶活力的作用。Chen 等 9人利用水醇提取法,结合离子交换、凝胶过滤和 RP-HPLC 从人参中分离出六种 含 a 氨基酸的小肽,并通过氨基酸序列分析已测定其结构为氧化性的谷胱甘肽及 其类似物,实验证明,它具有调节动物睡眠的作用。另外，一种结构为:Glu-Thr- Val -Glu-Ile-Ile-Asp-Ser-Glu-Gly-Gly-Gly-Asp-Ala 的 14 肽也是从人参中提 取出来,它具有强烈的抗脂解活性 10。吉林大学的张今等，1985 年报道用 717 型 和 732 型离子交换树脂柱从人参花蕾中分得两个酸性肽 11，氨基酸组成分别为 ：Asp-Thr-Ser-Glu-Gly-Ala-Val -Mat-Leu-Phe-Arg 分子量大于； ：Asp-Thr-Ser-Glu-Gly-Ala-Val -Ile-Leu-Lys，分子量大于 1200。1988 年， 他们又按照日本人 Ando 的分离程序及改进的分离程序（用 Sephadex G-25 凝 胶过滤） 12,13从人参中分离出一个具有胰岛素作用的 14 肽,认为是 Ando 得到的 14 肽，但存在一个氨基酸的差异,并用 DABITC/PICTC 双偶合法测定了序列为 Glu-Thr-Val -Glu-Ile-Ile-Asp-Ser-Glu-Gly-Gly-Gly-Asp-Ala。其后，又用 CD 谱研究了该肽的研究二级结构 14；生理活性研究表明有抗脂肪分解及降低血糖和 肝糖作用 15, 16；对该肽的基因进行了化学合成和克隆 17。白求恩医科大学的徐景 达等也从事了这方面的工作，1990 年报道从人参中用 DEAE-Cellulose 和 HPLC 纯化了两个肽 8，氨基酸组成分别为： 2Asp,2Ser ,3Glu,3Gly,Ala,Lys， 分 子量 1300 左右；： 2Asp,2Ser,3Glu,2Gly,Ala,Pro，分子量 1000 左右。1991 年又报道从红参中经 DEAE-Cellulose，Sephadex G-10 和 RP-HPLC 纯化得到两 个肽 18,其一为 13 肽，3Gly,2Ser,2Glu,Ala,2Asp,Thr,Leu,Val；另一为 15 肽， 4Gly,3Ser,2Glu,2Ala,Asp,Thr,Leu,Ile。测出了 15 肽的 N 末端为 Asp，各肽均 未给出一级结构。 进入 90 年代中期，由于现代生物技术在中药领域的广泛应用，对于人参蛋 白的研究才日益增多。应用二维电泳技术现已表明人参中共有人参蛋白 300 多种， 其中已被报道的仅有 40 多种 19,20，主要包括：（1）类 RNA 酶蛋白：类 RNA 酶蛋 白是人参的主要蛋白（ginseng major protein，GMP） ，分子量为 28kDa，其氨 4 基酸序列与植物的 RNA 酶具有高度同源性。二维电泳分析显示 GMP 的含量随季节 的变化而变化，因此这一蛋白也被认为是人参的储存蛋白。 （2）核糖核酸酶：Lam 和 Ng 从人参根中分离得到一种由 27kDa 和 29kDa 两个亚基组成的非耐热核糖核 酸酶，其具有抗真菌、抗病毒和抑制增殖的活性。随后他们又从人参花蕾中分离 得到一分子量 23kDa 的核糖核酸酶，但却没有抗真菌、抗病毒和抑制增殖的活性。 Gennady 也从人参愈伤组织中分离得到两种分子量都为 18kDa 的核糖核酸酶 21。 （3）几丁质样蛋白：分子量 15kDa，具有抗真菌功能25。 （4）木聚糖酶：从人 参根部提取的木聚糖酶，分子量只有 15kDa，明显低于从其他药用植物分离得到 木聚糖酶，最适酶活温度为 50，具有人 I 型免疫缺陷病毒转录抑制的活性。 （5）皂苷 -葡萄糖苷酶：从人参中分离的皂苷 -葡萄糖苷酶能水解人参皂苷 Rg3，得到抗癌物质人参皂苷 Rh2，分子量 59 kDa，最适酶活温度为 60。 1.3 蛋白质及多肽在中药鉴别中的重要地位 一味正品药材，不但要求基原正确，性状、显微特征无误，还必须对中药材 所含的有效成分、主成分或特征性成分等指标成分进行定性、定量分析。而这些 指标成分往往集中于糖、生物碱、苷类、挥发油等。动、植物类中药细胞中普遍 含有受遗传基因控制的蛋白质分子，且有种的特异性和稳定性，因此，利用蛋白 质种类的不同来鉴别那些亲缘关系相近、性状类同的中药是有理论依据的，在实 验方法上也是有效可行的 22 。利用这一规律，以蛋白质分子为指标进行中药鉴别， 对于丰富中药质量标准体系是非常重要的。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳作为一种经典技术在蛋白质研究中被广泛应用。 应 用这一技术，可以根据电泳的蛋白谱带数、泳动率、着色深浅、特征蛋白分子量 等来进行中药鉴定及质量研究。由于传统的性状鉴别易受人为因素影响，通常需 要多种方法配合才能准确鉴定。目前，中药鉴定的发展方向是中药鉴别客观化、 标准化、现代化。凝胶电泳鉴别技术,为中药鉴别学科开辟了新的领域,并提供了 一项新的检测手段和生化指标，使中药鉴别方法更趋合理和完善 23 。 1.4 本课题研究的内容及意义 蛋白质的复杂结构导致其物理和化学性质的不稳定，很多因素都可以导致其 变性失活，因此在蛋白质提取分离过程中，要综合各影响因素所带来的不利影响， 长春工业大学人文信息学院学士学位论文 5 本文综合考察了不同 pH 值、不同料液比、不同浸提时间等影响因素对蛋白提取率 的影响,确定了最佳提取工艺。传统的蛋白质提取方法是：采用中性缓冲液浸提， 硫酸铵沉淀获得总蛋白。此方法操作繁琐且收率和纯度很低,不利于大规模生产 24- 28。本文通过正交试验结合膜分离技术，建立了一种获得高纯度、高收率人参蛋 白的提取方法。同时，本文采用等电点分离结合凝胶过滤层析技术，从人参总蛋 白中分离纯化出了分子量为 5027Da 的人参多肽，并对其理化性质及活性进行研 究，为人参药材药用价值的发挥及有效成分研究奠定了基础。 6 第二章 材料与仪器 2.1 材料与试剂 2.1.1 原料 鲜参、山参、西洋参购于吉林省抚松县，采集时间为 2010 年 9 月共 20 批样品均 属于五加科植物人参(Panax giseng C.A. Mey. ) 野山参是指野外自然生长的人 参。西洋参为五加科植物西洋参（Panax quinquefolium L.） ，生长年限为 4 年、 5 年。 2.1.2 其它材料与试剂 三羟甲基氨基甲烷（Tris 碱） Genview 电泳纯 磷酸氢二钠（Na2HPO4） 北京化工厂分析纯 磷酸二氢钠（NaH2PO4） 北京化工厂分析纯 甘氨酸 Sigma 电泳纯 丙烯酰胺 Sigma 电泳纯 过硫酸铵 Sigma 电泳纯 十二烷基硫酸钠（SDS） Sigma 电泳纯 -巯基乙醇 Genview 电泳纯 N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED） Amresco 电泳纯 考马斯亮蓝 R250 Sigma 电泳纯 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白 上海生物化学研究所 Bradford 蛋白含量试剂盒 Sigma 公司产品 MTT Sigma 公司产品 DMSO Sigma 公司产品 胰蛋白酶 Gibco 公司产品 DMEM 培养基 Gibco 公司产品 长春工业大学人文信息学院学士学位论文 7 2.2 仪器 名称 型号 厂家 电子天平 DT100 常熟市双杰测试仪器厂 电子天平 TA1203N 上海精密科学仪器有限公司 超声波清洗器 KQ-3200B 昆山市超声仪器有限公司 循环水式多用真空泵 SHB-3 郑州杜甫仪器厂 微机型酸度计 pHS-25CW 上海理达仪器厂 高速组织捣碎机 DS-1 上海标本模型厂 冷冻干燥机 LL3000 德国 Heto 公司 磁力搅拌器 JB-1B 上海雷磁新泾仪器有限公司 漩涡混合器 XW-80A.H-1 上海精科实业有限公司 高效液相色谱仪 1100 美国 Angilen 公司 超纯水机 WP-RO-20 四川沃特尔仪器有限公司 台式大容量离心机 TDL-5 上海安亭科学仪器厂 高速离心机 Mini Eppendorf 公司 垂直板电泳槽 DYCZ-24D 北京六一仪器厂 电泳仪 DYY-8C 北京六一仪器厂 紫外可见分光光度计 UVmini -1240 日本岛津公司 凝胶排阻液相色谱柱 TSK-G2000SWxl TOSOH 公司 酶标仪 Multiskan MK3 Thermo 公司 倒置生物生物显微镜 XSB-1A 中国广西梧州市学仪器厂 中空纤维膜过滤系统 QuixStand GE Healthcare 中空纤维过滤柱 0.65m GE Healthcare 纤维过滤膜堆 100kD GE Healthcare 凝胶电泳图像分析系统 JD801 江苏省捷达科技有限公司 二氧化碳培养箱 HERAcell150 Thermo 公司 双人净化工作台 SW-CJ-2D 苏州净化设备有限公司 高压灭菌器 01J2003OA 上海博迅实业有限公司 8 第三章 实验方法 3.1 人参多肽的分离纯化 3.1.1 人参多肽的提取制备 取本实验制备的人参总蛋白样品 100mg，10mM pH7.4 的 PBS 缓冲溶液溶解， 置于截留分子量为 6000-8000Da 的醋酸纤维素透析带中，对 10mM pH6.5 的醋酸 铵缓冲溶液透析， 6000rpm 离心 15min， 沉淀用含 2M 盐酸胍的 10mM pH7.4 的 PBS 缓冲溶液溶解，经截留分子量为 10kD 的中空纤维超滤柱分离，收集外率液， 再经截留分子量为 1KD 的中空纤维超滤柱除盐并浓缩，真空冷冻干燥机冻干，得 人参多肽粗品。 3.1.2 人参多肽的纯化 取人参多肽粗品 10mg，用 10mM pH7.4 的 PBS 缓冲溶液溶解，0.22m 滤膜过 滤，经 Sephadex G-75 凝胶柱层析分离，收集洗脱峰。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测 按 3.1.3 项下步骤进行电泳检测。 3.1.3 高效凝胶过滤色谱（HPGFC）检测 排阻极限：5-150kD，流动相：20mM 磷酸盐缓冲溶液含（10mM 硫酸钠） ，柱 温：25，流速：0.5 ml/min，检测波长：280nm。 3.1.4 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测 将人参多肽纯品用去离子水稀释至约 110-6mol/L，取 10l 此稀释液，加 入等体积的芥子酸混匀，再加入 1l 的 0.1% 三氟乙酸水溶液混匀。取 1l 此溶液滴于进样探头上抽空除去溶剂，使样品/基质混合物在探头上形成均匀的结 晶，直接进样分析。质谱信号为单次扫描累加 50 次，以正离子谱测定。 长春工业大学人文信息学院学士学位论文 9 3.2 人参多肽的活性研究 3.2.1 细胞系 3T3 细胞株； 2BS 细胞株； Hep-2 细胞株。 3.2.2 试剂配制 (1)培养基 将一袋 DMEM 培养基全部倒入一容器中， 用少量去离子水将袋内残留培养基 洗下，并入容器。加去离子水（水温 2030）到 950ml，轻微搅拌溶解后， 加入 2.438g 碳酸氢钠，轻微搅拌溶解，加去离子水至 1L。用 1mol/L 氢氧化钠溶 液或 1mol/L 盐酸溶液调 pH 值为 7.2，用 0.2 m 滤膜过滤除菌，4保存。 (2)青、链霉素混合液（简称 SP液或双抗液） 青霉素（40 万 U）5 支，链霉素（200 万 g）1 支，分别溶于 100ml 灭菌去 离子水中或共同溶于 200ml 灭菌去离子水中，混合后分装小瓶，置-20冰箱保存 备用（1 万单位 g/ml） 。临用时，按 1%的量加入培养液中，最后浓度是青霉素 100U/ml，链霉素 100 g/ml。 (3)PBS 缓冲液 称取 0.20g KCl，8.00g NaCl，0.20g KH2PO4 ,1.56 g，Na 2HPO4H2O 加去离 子水至 1000ml，高压蒸汽灭菌（121，20min） ，用无菌 NaHCO3溶液调节 pH 值至 7.27.4，分装，4保存。 (4) Hanks平衡盐溶液 取 NaCl 8.00g，KCl 0.40g，CaCl 2 0.14g，MgSO 4 7H2O 0.20g，Na 2HPO4H2O 0.06g，KH 2PO4 0.06g，NaHCO 3 0.35g，葡萄糖 1.00g，酚红 0.02g，加去离子水至 1000ml，高压蒸汽灭菌（ 121，20min） ，用无菌 NaHCO3 溶液调节 pH 值至 7.27.4，分装，4保存。 (5)D-Hanks液 取 NaCl 8.00g，KCl 0.40g，Na 2HPO412H2O 0.134g，KH 2PO4 0.06g，NaHCO 3 0.35g，酚红 0.02g，加去离子水 1000ml，用 1mol/L HCl 或 NaOH 调整 pH 值至 7.3，高压灭菌（121，20min） ，4保存。 (6)胰酶消化液 10 500mg 胰蛋白酶粉剂加入 D-Hanks溶液至 200ml，完全溶解后，用无菌 NaHCO3溶液调节 pH 值至 8.0 左右，无菌过滤分装，-20保存。 3.2.3 传代细胞培养 从液氮灌中取出冻存管，迅速放入 37的水中 1-2min 使之融化。75%酒精 消毒管口后，旋开冻存管盖，用吸管吸取细胞悬浮液，注入细胞培养瓶中，用含 10%小牛血清、1%双抗的 DMEM 培养液适当稀释后，放入 5%CO2培养箱中培养，6h 后换液一次，以后按常规进行培养。当细胞生长铺满瓶壁后进行传代，其方法如 下：弃掉旧培养液，加入 0.25%胰酶消化液，消化 2min；吸出或倒掉消化液，加 入适量培养液用吸管轻轻吹打，使细胞悬浮；将悬浮液接种到新的细胞培养瓶中 传代培养。 3.2.4 样品配制 人参多肽：无菌称取 100mg 人参多肽冻干样，加 20ml PBS 缓冲液溶解，无 菌过滤分装，-20保存。 3.2.5 MTT 法检测人参多肽对细胞增殖的影响 将长满小鼠成纤维细胞 3T3、人胚肺二倍体细胞 2BS、及人喉癌细胞 Hep-2 的 细胞培养瓶中原来的培养液弃去，加入 2ml Hanks 液洗去残留培养液及部分死细 胞。加入约 3 ml 0.25的胰蛋白酶液（消化液体积以能覆盖整个瓶底为准） ，静 置 2-10 min（倒置显微镜下动态监测）,随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋 于圆形。吸去胰蛋白酶液，静置片刻，加入 5 毫升的培养液终止消化，用吸管反 复吹打瓶壁细胞，使形成细胞悬液，之后再加入 15ml 培养液吹打均匀。单细胞悬 液接种于 96 孔细胞培养板，调细胞密度约为 5105/l， 100l/孔。将加入细 胞的 96 孔板置于 37、5CO 2培养箱中培养 4-6h，待细胞贴壁后加入药物 （人 参多肽样品， 加入 pH7.4 的 PBS 缓冲溶液溶解，无菌过虑得） 。20l/孔，再补 加培养液 80l/孔，使样品的终浓度分别为 500 g/ml、50 g/ml、5 g/ml 和 1 g/ml。 设置细胞对照及空白对照，每种样品设 10 个复孔，对照为不含药物的 DMEM 培养液。37培养 48h 后，每孔加入 20l MTT（5mg/ml ,溶于 pH7.4 的 PBS 缓冲溶液） ，轻轻震荡后，37继续培养 4h 后吸出孔内培养液，加入 长春工业大学人文信息学院学士学位论文 11 DMSO（180l孔） ，将培养板置于微孔板振荡器上振荡，使结晶物溶解。于 Multiskan MK3 酶标仪，450nm 波长处测各孔的 OD 值，检测样品的生物活性。结 果以 XS 表示，数据采用 t 检验。 12 第四章 实验结果 4.1. 人参多肽的分离纯化 4.1.1 人参多肽的提取制备 人参总蛋白（100mg）经等电沉淀、超滤等步骤处理后，得到人参多肽粗品 （3mg） ，电泳结果 如下 1 2 图 1 人参多肽电泳图 1、 低分子量标准蛋白（自上而下分子量依次为 97kDa、66kDa、43kDa、31kDa、20kDa、14kDa） 2、人参多肽粗品 4.1.2 人参多肽的 Sephadex G-75 层析图谱 图 2 人参多肽 Sephadex G-75 图 长春工业大学人文信息学院学士学位论文 13 4.1.3 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 1、低分子量标准蛋白（自上而下分子量依次为 97kDa、66 kDa、43kDa、31kDa、20kDa、14kDa） 2-5、Sephadex G-75 洗脱峰 1 图 3 人参多肽 Sephadex G-75 洗脱组分电泳图 由图 2、3 可知，人参多肽粗品经 Sephadex G-75 柱层析后，获得了进一步的 纯化，电泳结果显示为单一条带。 4.1.4 高效凝胶过滤色谱检测 图 4 人参多肽 HPGFC 图 14 由图 4 可知，纯化后的人参多肽达到高效液相纯。 4.1.5 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测 图 5 人参多肽 MALDI-TOF-MS 图 由图 5 高效液相色谱图可知，人参多肽显示为单一峰，由图 5 质谱图可知， 人参多肽的分子量为 5027Da。 长春工业大学人文信息学院学士学位论文 15 4.2 人参多肽的活性研究 4.2.1 人参多肽对 3T3 细胞增殖影响 图 6 人参多肽对 3T3 细胞增殖影响 表 1 MTT 法检测人参多肽对 3T3 细胞增殖的影响（n =10） 由图 6 及表 1 可以看出，人参多肽对 3T3 细胞增殖有明显的促进作用。 组别 样品浓度（gml） 光密度 OD（XS） 阴性对照组 0 0.4000.015 实验组 20 0.4510.011 40 0.5080.009 60 0.5740.014 80 0.6420.012 16 4.2.2 人参多肽对 2BS 细胞增殖影响 图 7 人参多肽对 2BS 细胞增殖影响 表 2 MTT 法检测人参多肽对 2BS 细胞增殖的影响（n =10） 组别 样品浓度（gml） 光密度 OD（XS） 阴性对照组 0 0.2240.015 实验组 20 0.2270.011 40 0.2420.009 60 0.2330.014 80 0.2180.012 由图 7 及表 2 可以看出，人参多肽对 2BS 细胞增殖无明显影响。 长春工业大学人文信息学院学士学位论文 17 4.2.3 对 Hep-2 细胞增殖影响 图 8 人参多肽对 Hep-2 细胞增殖的影响 表 3 MTT 法检测人参多肽对 Hep-2 细胞增长的影响（n =10） 由图 8 表 3 以看出，人参多肽对 Hep-2 细胞增殖具有明显抑制作用。 组别 样品浓度（gml） 光密度 OD（XS） 阴性对照组 0 0.5210.012 实验组 20 0.4720.016 40 0.4380.015 60 0.3820.011 80 0.3310.013 18 第五章 讨 论 5.1 人参多肽的分离纯化 蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有 上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation） 、提纯（Purification） 和鉴定（Characterization）是生物化学中重要的一部分，至今还没有单独或一 套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，通常采取几 种方法联合使用。 蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白 质的结构状态， 引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。 这种现象称 为蛋白质的变性。在一定的环境条件下，蛋白质的一级结构能够决定二、三、四 级结构。变性蛋白质的二、三、四级结构虽然遭到破坏，但是一级结构仍然保持 不变，因此除去变性剂后，在适当的环境条件下，蛋白质能卷曲折叠成为能量最 低的构象，一般天然蛋白质正是具有这种能量最低的构象，这个过程称为复性。 蛋白质变性剂的作用是破坏蛋白质的次级键，如氢键、盐键和疏水力，引起 天然构象的解体；它们并不破坏共价键，如肽键(注：蛋白质变性过程中二硫键也 被破坏，二硫键属于共价键)故不涉及一级结构（一般认为，蛋白质的一级结构即 该蛋白质的氨基酸序列）的改变。 变性剂有溶解型和沉淀型两类，SDS、尿素和 胍盐是有效的溶解型变性剂，而三氯乙酸、甲醇、和氯仿 /异戊醇是有效的沉淀 变性剂。 超滤技术是通过膜表面的微孔结构对物质进行选择性分离。当液体混合物在 一定压力下流经膜表面时，小分子溶质透过膜（称为超滤液） ，而大分子物质则被 截留，使原液中大分子浓度逐渐提高（称为浓缩液） ，从而实现大、小分子的分离、 浓缩、净化的目的。实际应用中，可选择不同孔径的滤膜截留不同分子量的蛋白 质。 在我们的试验中，选择了相对分子量为 10kDa 的超滤膜。结果表明，大分子 蛋白与小分子蛋白基本可以完全分开。 凝胶过滤是根据蛋白质分子大小不同而达到分离效果的，凝胶过滤填料中含 有大量微孔，只允许缓冲液以及小分子量蛋白质通过，而大分子蛋白质以及一些 长春工业大学人文信息学院学士学位论文 19 蛋白质复合物被阻挡在外。因此，高分子量的蛋白质在填料颗粒间隙中流动，比 小分子量蛋白更早的被洗脱下来。 最大的蛋白质分子最早流出柱子， 因为它们 在到达柱底前经过的体积最小；中等的蛋白质可以进入填料分子中较大的孔内， 有最大的通过体积，故最后到达柱底。不同型号的凝胶介质的有效分离范围是不 一样的， 我们试验中选择的凝胶介质 Sephadex G-75 适合于小分子蛋白的分离。 5.2 人参多肽的活性研究 对人参蛋白的研究开始于上世纪 80 年代末 90 年代初，主要集中于人参蛋白 的提取方法，进入 90 年代中期，由于现代生物技术在中药领域的广泛应用，人参 蛋白的活性研究才日益增多。对人参蛋白及多肽的药理研究表明其在人参的生长、 发育及生物功能表达等方面都起着重要的作用，主要具有抗脂质分解、抗血红细 胞聚积、抗真菌、抗病毒、精氨酸酶活性等22-27。但在这些研究中都没有涉及 人参蛋白对细胞增殖影响及抗衰老活性，因此，我们的研究结果对揭示人参蛋白 的生物功能具有重要意义。 细胞活性检测是研究蛋白质生物功能的重要手段。细胞活性检测的方法很多， MTT（噻唑蓝）法因其简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿 瘤放射敏感性实验等69,70。MTT 在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C 的作用下，生成 蓝色的甲簪结晶，结晶的生成量仅与活细胞数目成正比而与死细胞无关。还原生 成的结晶用 DMSO 溶解，利用酶标仪测定光密度 OD 值。其吸光度值的大小可以反 映活细胞的数量及代谢活性，因此应用 MTT 比色法可定量测定药物对细胞的生长 抑制或增殖情况。 Hep-2 为人喉癌上皮细胞。人参多肽对 Hep-2 增殖具有抑制作用，且呈现一 定量效关系，说明人参多肽可能具有抑制上皮细胞癌生长作用，这进一步表明了 人参具有抗肿瘤作用。3T3 为正常小鼠成纤维细胞，人参多肽对其增殖具有一定 的促进作用，表明人参多肽可能具有促进成纤维细胞生长作用。研究表明，人参 中的皂苷类成分也具有促进成纤维细胞生长的作用。这提示我们，人参皂甙和人 参多肽联合使用，应可以更好的发挥人参抗衰老、增强机体免疫力等药效作用。 2BS 为人胚肺二倍体细胞，研究中未见人参多肽对其增殖有较明显的影响。 综合人参多肽对三种细胞生长的影响，可以看到人参多肽对不同的细胞具有 不同的作用。我们推测，这可能是由于人参多肽首先需要与细胞膜上的不同受体 20 结合，进而发挥不同的生理功能。正是由于不同细胞的受体类型不同，造成了人 参多肽对不同细胞作用的不同。本实验仅是对人参多肽生物功能的初步研究，对 于其抑制或促进细胞增殖的机理尚不很清楚，还有待于进一步研究。 长春工业大学人文信息学院学士学位论文 21 致 谢 经过一个多月的忙碌和工作，本次毕业设计已经顺利完成，作为一个本科生 的毕业设计，由于经验的匮乏，难免有许多考虑不周全的地方，如果没有老师的 督促指导，以及一起工作的同学们的支持，想要完成这个设计是难以想象的。 本文是在陈晓光主任的悉心指导下完成的。承蒙陈主任的亲切关怀和精心指 导，虽然有繁忙的工作，但仍抽出时间给予我学术上的指导和帮助，特别是给我 提供了良好的实验环境，使我从中受益匪浅。陈主任对学生认真负责的态度、严 谨的科学研究方法、敏锐的学术洞察力、勤勉的工作作风以及勇于创新、勇于开 拓的精神是我永远学习的榜样。在此，谨向陈主任致以深深的敬意和由衷的感谢。 其次，还要感谢大学四年来所有指导过,教育过我的老师，正是你们不倦的教 诲,使我打下了扎实的专业基础；同时还要感谢所有的同学们，正是因为有了你们 的支持和鼓励，此次毕业设计才会顺利完成。 最后感谢长春工业大学人文信息学院制药工程系四年来对我的大力栽培。在 这里，我仅用一句话来表明我无法言语的心情：感谢你！ 由于本人学识能力有限,定有许多不足之处,恳请答辩场各位老师多多指正.同 时,感谢你们为我付出的心血。 22 参 考 文 献 1 窦德强，靳玲，陈英杰.人参的化学成分及药理活性的研究进展与展望J. 沈阳药科大学学报，1999,16（2）: 151-156. 2 王红艳，徐绥绪，陈英杰，等.人参单体成分药理活性研究的新进展J. 中国药物化学杂志，1992,2（3）: 73-78. 3 Salisa C, Westrick, Jeanine K. Effects of repeated callbacks on response rate andnonresponse biasJ.Arch Pharm,2008,4(1):46-58. 4 Gstirnor F and Vogt H J. Poptidos in White Koroan GinsengJ. ArchPharm,1966,299(11):934-940. 5 Ando T, Muraoka T and Yamasaki N. Preparation of Anti-lopolytic Substance from PanaxGinsengJ