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类天疱疮和天疱疮患者肿瘤坏死因子 及可溶性肿瘤坏死因子型受体的测定 类天疱疮和天疱疮患者肿瘤坏死因子 及可溶性肿瘤坏死因子型受体的测定 中华皮肤科杂志 1999 年第 6 期第 32 卷 论著 作者：陈向东 翁孟武 陈洪 苏玮 侯爱琴 单位：陈向东 200011 上海第二医科大学附属第九医院皮肤科；翁孟武（指导者） 苏玮 侯爱琴 上海 医科大学附属华山医院皮肤科；陈洪 上海第二医科大学微生物教研室 关键词：类天疱疮；大疱性天疱疮肿瘤坏死因子受体；肿瘤坏死因子 【摘要】目的 探讨肿瘤坏死因子 (TNF)及其可溶性型受体(sTNF-R) 在类天疱疮（BP） 、天疱疮 （PV）患者疱液和血清中的变化及其临床意义。方法 应用 ELISA 方法对比研究 31 例 BP、9 例 PV 患者血 液和疱液中 TNF 和 sTNF-R 的含量。并以 15 例正常人吸疱液和 30 例正常人血清作对照。结果 BP、PV 患者活动期疱液和血液中 sTNF-R水平均高于对照，且疱液中浓度更高；BP 缓解初期血中 sTNF-R水平 高于活动期；BP 患者血液和疱液中均未测到或有极少量 TNF，PV 患者血液中仅测到低浓度的 TNF，而 疱液中 TNF 浓度明显高于对照。结论 细胞因子 sTNF-R和 TNF 可能参与了 BP 和 PV 的发病，sTNF- R在 BP 中可能对机体起保护作用，有望成为病情好转和治疗有效的新的观察指标。 Levels of Tumour Necrosis Factor and Its Soluble Receptor Type in Sera and Blister Fluids of Patients with Autoimmune Bullous Dermatoses CHEN Xiangdong,WENG Mengwu,CHEN Hong,et al. Department of Dermatology,Huashan Hospital of Shanghai Medical University,Shanghai 200040 【 Abstract】 Objective To determine the relationship between tumour necrosis factor (TNF ) and its soluble receptor type (sTNF-R) and their significance in autoimmune bullous dermatoses.Methods The levels of TNF and sTNF-R in both sera and blister fluids of 31 cases with bullous pemphigoid(BP) and 9 cases with pemphigus vulgaris(PV)were investigated by ELISA.Fifteen suction blister fluids and 30 sera from normal inpiduals were taken as the control.Results At active stage， the levels of sTNF-R were higher in both the sera and blister fluids from patients with BP and PV than those from the controls,and were much higher in blister fluids than in sera.The serum level of sTNF-R was even higher at early remission stage than at active stage of BP.There were traces or undetectable amount of TNF in both sera and blister fluids of BP cases. TNF level was much low in sera of PV cases, but higher in PV patients blister fluids than in control groups.Conclusion sTNF-R and TNF might be related to the pathogenesis of the two diseases, and the former might exert a protective effect on the inflammatory reaction and might serve as a new indicator for evaluation of the severity of BP and the effectiveness of therapy. The effects of sTNF-R and TNF in BP and PV might be different. TNF might be much important for blister formation in PV. 【 Key words】 Pemphigoid,bullous Pemphigus Tumor necrosis factor Receptors,tumor necrosis factor 肿瘤坏死因子 （TNF）是一种多功能的细胞因子，它不仅对肿瘤有直接的细胞毒作用，还具有多种免 疫调节活性。与之相对应的可溶性肿瘤坏死因子型受体（sTNF-R）在调节 TNF 的生物学活性中起了 很大的作用。我们对 40 例自身免疫性大疱病患者的血液和疱液中 TNF 及 sTNF-R进行测定。 材料和方法 （一）病例：40 例患者均选自本院门诊或住院病例，其中类天疱疮（ BP）31 例、天疱疮（PV）9 例。男 23 例，女 17 例，平均年龄（56 20）岁（2598 岁） 。所有病例经临床、病理、DIF、IIF 及 1mol/LNaCl 盐 裂后免疫荧光证实，并排除其它感染情况。 （二）血清和疱液：所有患者同时抽取未经治疗（1 个月内未用过皮质类固醇或免疫抑制剂）的活动期 (指 患者不断出现水疱或红斑)血液及 24h 内新发之水疱疱液。11 例 BP 患者在病情控制后即抽取缓解期( 指治 疗后无新发水疱，无明显炎症约 1 周) 血液。离心后分别取血清及上清液，分装， 30保存。另外，30 例正常人血清及 15 例正常人的吸疱液作为对照。 (三)ELISA 方法测定血清、疱液中 TNF、sTNF-R：从试剂盒（美国 Gibco 公司生产）中取出所需已包 被相应单抗的板条。加入标准品稀释液 100L 至空白孔和零孔，将待测血清或疱液和已稀释的不同浓 度的标准品各 100L 加入相应孔中，用封板胶封住反应孔，37孵育 90min，用清洗液洗板。除零孔外， 每孔加稀释好的 1600 生物素标记二抗 100L，封住板孔， 37孵育 60min 后洗板。除零孔外，每孔 加稀释好的酶联物 100L，封住板孔，37孵育 30min 后洗板。 每孔加底物 A、B 各 50L，避光， 37 孵育 15min。每孔加终止液 50L，混匀。即刻在 450nm 波长的酶标仪下读数。制作标准曲线 并根据标准曲线查找各标本相应浓度。 (四)统计学方法：检测数据用 SPSS 统计软件进行统计学处理。变量用秩和检验或 t 检验。 结果 （一）31 例 BP、9 例 PV 患者活动期血清、疱液中 TNF、sTNF-R的检测结果见表 1。BP 、PV 患者活动 期疱液和血液中 sTNF?RI 水平均高于对照，且疱液中浓度更高。BP 患者活动期血液和疱液中 TNF 的含量 明显低于对照。PV 患者血液中仅测到极低浓度的 TNF，而疱液中 TNF 浓度明显高于对照。 （二）11 例 BP 患者活动期和缓解初期血清中 TNF、sTNF-R的比较见表 2。BP 缓解初期血清中 sTNF?R水平较活动期高。TNF 水平则明显低于对照。另外，我们还对 2 例疗效不佳一直未愈的 BP 患者 发病初期、病程 4 周和 8 周时血中 sTNF-R水平进行动态观察，检测结果分别为 2150、1800 、1600pg/mL 和 1275、1175、1050pg/mL ，均显示 sTNF-R在 4 周和 8 周时反较发病初期逐渐降低。 表 1 类天疱疮与天疱疮患者活动期血清和疱液肿瘤坏死 网址： 第 3 页，共 7 页 因子 及可溶性肿瘤坏死因子型受体的测定结果(pg/mL) 组别 例数 肿瘤坏死因子 可溶性肿瘤坏死因子型受体 s t 值* P 值 s t 值* P 值 血清 类天疱疮 31 3.95.3 579.5 0.01 1568785 4.83 0.01 天疱疮 9 2.67.7 71 0.01 19071139 4.55 0.01 正常人对照 30 11.64.2 758238 疱液 类天疱疮 31 8.612.3 519 0.01 34321470 6.07 网址： 第 5 页，共 7 页 0.01 天疱疮 9 60.155.3 156 0.01 46081416 9.14 0.01 正常人对照 15 34.726.6 1054436 注：*与正常人对照比较 表 2 11 例类天疱疮患者活动期和缓解期血清肿瘤坏死因 子 及可溶性肿瘤坏死因子型受体的测定结果(pg/mL) 项目 例数 肿瘤坏死因子 可溶性肿瘤坏死因子型受体 s t 值 P 值 s t 值 P 值 活动期 11 3.25.5 1190.05 1106306 3.380.01 缓解期 11 1.12.2 1671567 讨论本研究对 31 例 BP 患者测定细胞因子结果表明:BP 疱液与血中 sTNF-R明显高于对照，且疱液中 sTNF-R 又明显高于相应血清，说明皮损处能大量产生或浓缩 sTNF-R。国外报道 BP 皮损处有大量可表 达 TNF-RI 的浸润细胞如巨噬细胞，推测这些浸润细胞可能是 sTNF-R的来源。因此，sTNF-R与 BP 发病 有关。患者缓解初期血中 sTNF-R水平比活动期高(P0.01)，提示其升高可能与病情好转有关，是否可 将此作为观察病情的指标，是否其在高浓度时能拮抗 TNF 的毒性而成为机体的一种保护机制，有待探讨。 另外，我们对 2 例未能缓解的 BP 患者随访测定 sTNF-R的水平未见其升高，反而降低，进一步说明 sTNF- R的水平与病情活动性相关。BP 患者血液及疱液中 TNF 含量均低于对照组，推测可能是由于高浓度 sTNF-R 结合了 TNF 所致。与尹国华报道相似，但与 Zentener 的结果不完全相同。后者在疱液中测到大 网址： 第 7 页，共 7 页 量与 sTNF-R结合而失活的 TNF。我们的实验结果发现，疱液中 TNF 浓度明显高于血液（P0.05） ， 提示 TNF 主要在皮损局部产生。 9 例 PV 患者的活动期血清和疱液中 TNF 及 sTNF-R的测定结果表明:PV 疱液和血液中 sTNF-R明显高 于对照，且疱液又明显高于血清，说明 sTNF-R可能与 PV 发病机制有关，而且皮损处可能有大量 sTNF- R产生。血清中 TNF 含量低于对照，而疱液中却明显高于对照（ P0.01） ，提示 TNF 在皮损处大 量产生，血清中 TNF 的低含量可能与高浓度的 sTNF-R 的结合消耗有关。PV 疱液中 TNF 含量高于 对照，而 BP 疱液中却低于对照，提示在 PV 发病中有更多 TNF 产生，在 PV 水疱形成中起更重要的作用。 也许正因为 PV 水疱中含较高浓度 TNF 这一炎症介质使得 PV 水疱炎症程度往往较重，说明 TNF 在 PV 和 BP 的发病机制中所起的作用有所不同。 参考文献 1 Ambach A， Zilliken D， Klingert B， et al.Characterization of the mononuclear infiltrate in bullous pemphigoid.Hautarzt, 1991， 43:8185. 2 尹国华，张开明