非靶向代谢组学用于藜芦妨害人参治疗脾气虚的机制研究

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 非靶向代谢组学用于藜芦妨害人参 治疗脾气虚的机制研究 摘要 采用超高效液相色谱串联 四级杆飞行时间质谱 （UPLC/QTOFMS）联用技术，通过非 靶向代谢组学方法分析大鼠尿液内源性 代谢物的变化，研究藜芦妨害人参发挥 药效作用的机制。建立脾气虚大鼠模型， 连续给药 15 天，测定力竭游泳时间及 血液中白细胞、红细胞、血红蛋白的含 量。结果表明，人参可显著提高脾气虚 模型大鼠的力竭游泳时间（p0.05） ，人 参与藜芦配伍后对脾气虚模型大鼠各项 指标均无显著影响（p0.05） ，表明藜 芦妨害了人参发挥药效作用。采用 UPLC/QTOFMS 技术及非靶向代谢组学 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 的方法分析了空白组、模型组、人参组、 藜芦组、参藜组对脾气虚模型大鼠的尿 液代谢组差异，其中主成分分析 （PCA）得分图显示各组代谢轮廓有显 著差别，并通过正交偏最小二乘法判别 分析（OPLSDA ）及数据库检索，鉴定 出 15 种人参干预调节脾气虚模型大鼠 的潜在生物标志物，从中找出了 7 种人 参藜芦配伍后减弱人参上述干预作用的 潜在生物标志物，并对其涉及的代谢通 路进行了系统分析。上述研究结果表明， 人参藜芦配伍后妨害了人参对脾气虚模 型大鼠的治疗作用，其机理可能是影响 人参对体内能量代谢、免疫平衡及氧化 还原反应等相关代谢的调节。 中国论文网 /8/view-12905571.htm P 键词人参；藜芦；配伍禁忌； 脾气虚；非靶向代谢组学 1 引言 “相反 ”是中药七情配伍理论的重 要组成部分，属于配伍禁忌，历代各家 本草均指出“ 十八反” 决不可用。金元时 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 期的医家张子和总结了前人各家之说创 作了十八反的歌诀，其中人参作为“百 草之王”应用于数万方剂中，与藜芦的 相反作用也成为最有代表性配伍禁忌之 一。 目前，关于“ 十八反 ”的作用机制 的争论主要集中在配伍后会增加毒性或 降低药效两个方面13。但是在临 床应用、合用后化学成分变化、药效毒 理以及药物吸收代谢等方面的研究表明， “十八反”都没有明显一致的规律 4。 因此有效地结合新的研究技术及方法对 配伍的每一个环节，如体内吸收、分布、 代谢、排泄和生理病理变化等情况进行 考察，挖掘其中的内在联系，有助于揭 示“十八反”的科学内涵5，6。 代谢组学作为系统生物学的分支， 是研究代谢组在新陈代谢某一动态时刻 的变化规律的一门学科7。它将人体 作为一个完整的动态系统，因此被越来 越多地应用于中医中药的相关研究中 8，9 。目前，最常用的分析方法是 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 核磁共振（NMR）和各种质谱联用，如 液质联用 （LCMS，UPLCMS ，UPLCMS/MS） ， JP 气质联用 （GCMS，GCQTOFMS/MS） ，电泳质 谱联用（CEMS ）和等离子体质谱 （ICPMS）等9 ，10。 代谢组学按其研究的目的可分为 靶向和非靶向代谢组学。其中靶向代谢 组学是研究少数几种或几类结构、性质 相似或生化功能相关的内源性代谢物。 非靶向代谢组学则是针对生物样品中尽 可能多的内源性代谢物进行研究11。 本研究拟通过采用非靶向代谢组 学的研究方法，结合 UPLCMS 联用技 术，在病理生理条件下考察“十八反” 中 人参与藜芦这一具有代表性的反药配伍 组合干扰、改变、降低或消除药效的作 用机制，为更好地诠释中医药配伍禁忌 传统理论提供科学依据。 2 实验部分 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 2.1 仪器与试剂 WatersAcquityUPLC 液相色谱系 统、QTOFSYNAPTG2HDMS 质谱仪 （美国 Waters 公司） ；MilliQ 超纯水仪 （美国 Millipore 公司） ；BC5300Vet 全 自动血液细胞分析仪（中国深圳迈瑞公 司生物医疗电子股份有限公司） ；乙腈、 甲酸（色谱纯，美国 Fisher 公司） ；红 细胞、白细胞、血红蛋白生化测定试剂 盒（中国长春汇力生物技术有限公司） 。 人参（PanaxginsengC.A.Mey. ） 购自吉林抚松县万良人参市场，藜芦 （VeratrumnigrumL.）购自安徽丰原铜 陵中药饮片有限公司，分别取人参、藜 芦及人参藜芦（以人参：藜芦 10KG- 3KG-51 比例合用）药材适量，加 10 倍体积水浸泡 1h，加热回流提取两次， 每次 1.5h，合并提取液，浓缩后冻干， 保存备用。 Wistar 大鼠（中国吉林大学白求 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 恩医学院动物实验中心） ，实验动物许 可证：SCXK （吉）20130001 。 2.2 动物实验 雄性 Wistar 大鼠随机分成 5 组， 分别为空白组、模型组、人参组、藜芦 组、参藜组。空白组及模型组给予相同 体积蒸馏水，其余各组分别灌胃给予相 应药物，每日 1 次，连续 15d。 除空白组外，其余各组在给药同 时开始造模13 。造模第 1 天灌胃 50白酒 10mL/kg，第 2 天以后每天灌 胃食醋 10mL/kg，同时喂饲体质量 5% 的硝黄饲料（正常饲料、大黄粉、芒硝， 以 60KG-3KG-51KG-3 KG-51 的比 例（质量比）混合均匀，即成） ，每日 下午大鼠背部固定质量约为体质量 10% 的铁丝，放入水深 50cm、水温 2527的水槽中游泳，以力竭为度 （大鼠鼻尖没入水面 10s 以上） ，共 15d。期间空白组大鼠喂饲正常饲料并 进行常规饲养。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 第 14d 给药 1h 后，测定各组大 鼠力竭游泳时间，并放入代谢笼中收集 24h 尿液，离心， 80保存备用。第 15d 给药 1h 后，麻醉大鼠，腹主动脉取血测定红细 胞、白细胞、血红蛋白含量。 2.3 色谱质谱条件及样品分析 选用 WatersACQUITYUPLCBEHC18 色谱柱 （50mm2.1mm，1.7m） 。 色谱条件：A 乙腈，B 超纯水 （0.1% 甲酸） ；梯度洗脱： 03min，5%20%A ；3 6min，20% 50%A ；69min，50%100%A。柱 温：30；流速：0.4mL/min，进样量 5L。 质谱条件：离子源 ESI；电离源 温度 120；锥孔气为氮气，流速 50L/h；去溶剂气为氮气，温度 350， 流速 800L/h。正离子模式下毛细管电压 3.0kV，锥孔电压 35V，提取锥孔电压 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 5.0V；负离子模式下毛细管电压 2.0kV，锥孔电压 35V，提取锥孔电压 5.0V。 在本实验中，使用质控 样品（Qualitycontrol，QC）进行方法验 证，用以保证整个分析系统的稳定性。 QC 样品是由每个样品各取 100L 混合 得到，为降低误差，样品检测为随机进 行。在对样品进行分析前，为平衡系统 先运行 5 次 QC 样品。在样品的检测过 程中，每检测 5 个正常样品后运行 1 次 QC 样品，以衡量系统的稳定性。 2.4 数据处理 采用 MassLynxV4.1 和 MarkerLynxApplicationManager 对 UPLC/QTOFMS 检测得到的数据进行峰 检测、峰对齐以及归一化。使用 EZinfo2.0 软件中的 PCA 和 OPLSDA 进 行多元变量分析。使用 SPSS13.0 软件 进行组间 t 检验。使用生物学数据库 HMDB（http ：/www.hmdb.ca/） 、 METLIN（http ：//） 和 KEGG（http：// ）进 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 行潜在生物标志物的鉴定和代谢通路的 分析。JP 3 结果与讨论 3.1 人参、藜芦及人参藜芦配伍 合用对脾气虚模型大鼠力竭游泳时间的 影响 游泳耐力下降是脾气虚证实验动 物模型最显著的表现之一14。本实 验结果（表 1）显示，与空白组比较， 模型组大鼠力竭游泳时间明显降低；与 模型组比较，人参组大鼠力竭游泳r 间显著延长，藜芦组无明显变化，表明 人参能够改善脾气虚模型大鼠游泳耐力 下降的状况，但与藜芦配伍合用后在一 定程度上降低了这种作用。LM 3.2 人参、藜芦及人参藜芦配伍 合用对 ZH（脾气虚模型大鼠血液中白 细胞、红细胞、血红蛋白含量的影响 传统中医认为气在机体内具有防 御作用，气不足时会导致脏腑组织功能 低下或衰退，其与现代免疫学有着相似 之处，现代医学认为红细胞和血红蛋白 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 下降会影响人体气体交换，进而影响中 医气的生成14 。本实验结果（表 2）表明，与空白组比较，模型组大鼠 白细胞、红细胞及血红蛋白明显降低 （p1 且有统计学意义的变量（p0.05）. Theurinarymetabolicprofilingwasanalyzed byusingUPLC/QTOFMSandtheobtainedda tawereanalyzedbyPCA.ThescoreofPCAsho wedthattherewassignificantdifferenceamon gthemetabolicprofileofdifferentgroups.Acc ordingtotheresultsofOPLSDAandthedataba ses，fifteenpotentialbiomarkerswereidenti fiedasthetherapeuticeffectofPanaxginseng ，andsevenofthemandtheirpathwayswerec onsideredasreducingthetherapeuticeffectof PanaxginsengbycoadministrationwithVerat rumnigrum.Theresultsindicatedthattheeffec tofPanaxginsengonpromotingenergymetab olism，regulatingimmuneandantioxidation inthespleenqideficiencyratsweredecreaseda fterthecompatibilityofPanaxginsengandVer atrumnigrum. -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 KeywordsPanaxginse