“贺氏三通法”针刺不同时间介入对脑缺血再灌注大鼠模型血浆β-ep、acth的影响

“贺氏三通法”针刺不同时间介入对脑缺血再灌注大鼠模型血浆 - EP、ACTH 的影响 1 郭静 1 张露芬 2 刘红 1 孙敬清 1 马昕宇 1 摘要 目的 观察“贺氏三通法”针刺不同时间介入对脑缺血再灌注模型大鼠血清血浆 -EP 和 ACTH 含量变化的影响，探讨针刺对大鼠脑缺血再灌注后机体反应的调节机制。 方法 采用线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉脑缺血再灌注模型，采用放射免疫法检测血清 血浆 -EP 和 ACTH 含量。 结果 脑缺血再灌注大鼠血浆 -EP 含量明显增高，而 ACTH 呈下降趋势，不同时间介入“贺氏三通法”针法治疗后血浆 -EP 含量下降， ACTH 含量 增高，而且以 3h 介入治疗逆转 -EP 与 ACTH 的比值失调更为明显。结论 “贺氏三通 法”针法可以调节脑缺血再灌注大鼠 -EP 与 ACTH 的比值失调，且以 3 小时介入效果最 为理想。 关键词 贺氏三通法/针灸疗法；脑缺血再灌注； -EP ；ACTH 贺普仁教授在 50 多年的医疗实践中，创立了“病多气滞，法用三通”的中医针灸病机 学说和响誉海内外的针灸治疗体系“贺氏三通法”。“贺氏三通法”即毫针微通，三 棱针强通和艾灸、火针等温通三法。它在我国针灸界享有盛誉，具有显著的疗效和众多的 适应症。应用于缺血性脑卒中各期疗效显著，临床疗效的验证及总结已在国家中医药管理 局课题的支持下完成，经证实能显著提高脑卒中患者的疗效。本项实验研究以脑缺血再灌 注模型作为研究对象，观察血浆 -内啡肽（-endorphins，-EP）和促肾上腺皮质激素 （adrenocorticotropic hormone，ACTH ）含量的变化，旨从应激方面探讨“贺氏三通法”的 作用机制。 1 材料与方法 1.1 实验动物及分组 健康成年 SD 大鼠，雄性，体重 210-240g，清洁级动物，购自中国军事医学科学院动 物中心 。 采取随机抽签的方法将实验动物分为 5 组，分别为正常对照组（8 只） 、假手术组（8 只） 、模型对照组（8 只） 、针刺治疗组（24 只） 、药物治疗组（16 只） 。其中，根据介入治 疗时间不同针刺治疗组又分为 3h 针刺组（8 只） 、6h 针刺组（8 只） 、48h 针刺组（8 只） ， 药物治疗组分为 5h 组药物（8 只） 、48h 药物组（8 只） 。 正常对照组常规饲喂，不予处理；模型对照组造模后不予处理；假手术组除不插线外， 其余处理同模型对照组；3h 针刺组、6h 针刺组和 48h 针刺组分别在在造模成功后 3h、6h、48h 开始介入针刺治疗，每日治疗一次，每次 20 分钟，即 3h、6h 针刺组共治疗 3 次，48h 针刺组共治疗 2 次；5h 药物组和 48h 药物组分别在造模成功后 5h、48h 后开始 腹腔注射注射香丹注射液（按 15ml/100g 大鼠体重计算） ，每日一次，即 5h 药物组共治疗 3 次，48h 药物组共治疗 2 次。假手术组、模型对照组、针刺治疗及药物治疗各组均于造模 成功后 72h 取材。 1.2 模型制备及模型成功的标准 ?国家中医药管理局中医临床诊疗技术整理与研究项目： 2000ZL03 作者单位：1100010，首都医科大学附属北京中医医院针灸科 2100028，北京中医药大学针灸学院针灸机理实验室 2 1.2.1 模型制备：参照 Zea longa 线栓法 1制备模型。用 10%水合氯醛（0.35ml/100g）腹腔 注射麻醉后，仰卧固定，取颈正中切口，暴露右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉（ECA） 、颈 内动脉（ICA） 、结扎 CCA 近心端，双侧结扎及其分支，用动脉夹夹住 ICA，在 接近 ICA 和 ECA 分叉处剪一约 0.2的切口，将一长约 4的烧好头的栓线由 该切口插入后进入，直至颅底，越过大脑前动脉的起始部，到达大脑中动脉 （MCA）的前部，长度约为 2.00.4cm，阻断左侧大脑中动脉的血流。用庆大霉素消炎后 封闭皮肤切口，切口外留 1长的线端，以便将栓线拔出再灌注。造模 2h 后将线拔出， 使大脑中动脉再灌注。 1.2.2 模型成功的标准为:对侧 Hornor 征；提尾时对侧前肢内收屈曲；爬行时向对侧 倾倒或按顺时针方向转圈。模型不成功者均被剔除，随机补充，保证每组 8 只不变。 1.3 “贺氏三通法”治疗方法 1.3.1 取穴及针法： 取穴：百会、十宣、曲泽、委中，取穴及定位参见实验针灸学标准取穴 2。 针法：3h 针刺组、6h 针刺组前 2 次治疗（即造模后 36 小时以内）以“贺氏三通法”之强 通法，取上述诸穴三棱针放血，出血量至少一滴；3h 针刺组、6h 针刺组第 3 次治疗和 48h 针刺组（即造模后 36 小时以后）以“贺氏三通法”之温通法和微通法，上述诸穴以火 针点刺后毫针留针治疗，留针 20min，每日治疗一次,各组针刺的深度和强度均相同。最后 一次治疗后 2h 取材。 1.3.2 针具：神龙牌 31 号 0.5、1、1.5 寸针灸针，贺氏细火针、三棱针 1.4. 指标检测 1.4.1 标本采集：各组均在造模成功 72h 后取材。各组大鼠断头取血 3mL，注入预先加好抗 凝剂（EDTA50L、抑肽酶 40L）的试管中，混匀，静置片刻低温离心 （3000rpm，15min）分离血浆，-70保存待测。 1.4.2 指标检测：采用放射免疫法测定血浆 -ET 、ACTH 含量。放免试剂盒均购自北京华 英生物技术研究所。 1.5 数据处理和统计学分析 所有数据采用均数标准差（ ）表示，各组组间差异采用方差分析，以 P0.05） ； 与模型对照组比较，各个针刺组和药物组均有不同程度下降，经统计学处理， 3h 针刺组差异显著（ p0.05） ，5h 和 48h 药物组均无显著差异（p0.05） ； 各个针刺组间比较，3h 针刺组含量最低，与其余各组比较，经统计学处理无显著差异 （p0.05） ；与 5h 药物组比较，3h 和 6h 针刺组经统计学处理均无显著差异（p0.05） ；与 48h 药物组比较，48h 针刺组经统计学处理无显著差异（p0.05） 。 2.2 血浆 ACTH 含量的变化（结果见表 1） 结果表明：与正常对照组比较，假手术组 ACTH 含量有上升趋势，经统计学处理，无 显著差异（p0.05 ） ，模型对照组含量明显下降，经统计学处理，差异显著 （p0.05） ，6h 和 48h 针刺组差异显著（均为 p0.05） ，48h 药物组差异显著（p0.05） ， 余各组间均无显著差异（p0.05） ；与 5h 药物组比较，3h 和 6h 针刺组经统计学处理均无 显著差异（p0.05 ） ；与 48h 药物组比较，48h 针刺组有下降趋势，经统计学处理无显著差 异（p0.05） 。 表 1：各组大鼠血浆 -ET 和 ACTH 含量的变化（pg/ml） （ ） 分组 例 -ET ACTH 正常对照组 8 79.93555.725 15.9718.909 假手术组 8 164.73887.691 18.1046.035 模型对照组 8 222.380133.344 8.6693.209 3h 针刺组 8 93.40896.307 11.6474.003 6h 针刺组 8 165.113142.577 16.4147.830 48h 针刺组 8 147.836105.485 15.8078.032 5h 药物组 8 190.107129.022 15.82011.579 48h 药物组 8 132.457122.774 14.5106.542 注：与正常对照组比较， p0.05， p0.01；与假手术组比较， p0.05， p0.01；与模型对照 组比较， P0.05， P0.01。 3 分析 3.1 选穴意义 贺普仁教授在“病多气滞，法用三通”的思想指导下，将毫针微通、三棱针强通和艾 灸、火针等温通三法有机结合，提出“贺氏三通法”，具有显著的疗效和众多的适应症。 其中应用于中风病之急性期与恢复期治疗已列为国家中医药管理局诊疗技术整理课题（已 结题），经临床验证疗效优于常规针刺治疗，具有广阔的前景。 中风急性期之实证以气血上逆、痰火内闭、瘀血阻痹等表现之危、急、重症为突出特 点，根据“贺氏针灸三通法”理论，必须用局部放血疗法以治血调气。此期应用放血疗法 目的在于主要针对其病机发挥强通法清热泻火、止痛、镇吐、救急危症等方面作用。同时 配合微通法以畅气机、行气血。恢复期、后遗症期以血瘀、痰凝、气机不畅致经脉 失养为主证，多气虚血瘀、脉络痹阻而肢体废而不举或拘挛不伸，主要用微通 法通调经脉及火针疗法温通经脉、行气活血。临床取穴以百会、十宣、曲泽、委中 三棱针放血（放血仅用于急性期），四神聪、中脘、曲池、天枢、合谷、丰隆、太冲为主。 近年来随着对脑卒中病理生理过程认识的深入，针刺治疗缺血性卒中的基础研究显示 了良好的疗效，能改善血液与血管功能的异常，增加缺血区血流量；打破脑组织缺血后一 连串病理级联反应的恶性循环；激发脑组织自我保护机制，促进神经功能恢复。然而“贺 氏三通法”在临床上治疗缺血性脑卒中疗效显著，但其作用的环节及规律尚较少报道，为 此本研究重点观察了“贺氏三通法”不同时间介入对脑缺血再灌注模型大鼠的影响机制。 本课题以大鼠脑缺血再灌注模型为研究对象，探讨“贺氏三通法”调节脑缺血再灌注 所致脑功能紊乱的内在机制，以“贺氏三通法”取穴规律选取百会、十宣、曲泽、委中， 百会位于头之巅顶，令其出血可使逆上血气下降，暴张之阳得平，瘀滞经脉通畅；十宣调 和阴阳之气以醒脑开窍；曲泽、委中为合穴，气血充盛，泻之有行气活血通络之功。 3.2 “贺氏三通法”对脑缺血再灌注模型大鼠血浆 -ET 和 ACTH 的影响 4 脑缺血再灌注引起的病理级联反应的恶性循环导致机体处于持续的恶性应激刺激状态， 致使机体免疫调节亢进，从而启动 HPA 轴功能，引起神经- 内分泌 -免疫网络功能的紊乱， 继而加重了对机体的损害。 相关研究报道阿黑皮素原（POMC)主要由垂体前叶的促皮质激素分泌细胞和垂体中叶 的促黑色素细胞合成，并贮存于细胞内，可加工成不同的神经肽类，如 -ET 及 ACTH。 它们主要参与体内的生理活动，特别与应激反应有关。在应激状态下，-ET 及 ACTH 释 放增加，血浆含量也相应增加，这两种神经肽类可作为判断应激水平的敏感指标 34。 同时，-ET 和 ACTH 也是神经- 免疫-内分泌网络调节中的重要成分。 Blalock 等学者 于 1994 年提出神经肽/神经递质、激素、细胞因子是网络中相互调节的共同介质，或称 “共同语言 (commonlanguage) ”。免疫细胞产生的激素或神经肽一般较下丘脑 -垂体细胞分 泌的量少，但因免疫细胞数量较垂体细胞多，所以这种差异可以得到弥补。目前研究发现 淋巴细胞和巨噬细胞也可以产生 ACTH 和 -ET，其氨基酸序列与垂体内分泌细胞中的 ACTH 和 -ET 完全相同 5 。ACTH 主要通过与位于神经、免疫及内分泌系统的细胞膜上 的 ACTH 受体结合，激活腺苷酸环化酶，引起 cAMP 的产生，从而发挥对神经 -免疫-内分 泌系统的调节作用 6。-EP 是一种由 31 个氨基酸组成的内源性阿片肽，与多种疾病和应 激反应的病理生理过程密切相关，在各种应激状态下如缺氧、缺血、创伤、休克等时，其 合成分泌增加 7。-EP 可以通过阿片受体的作用和非阿片受体样作用对免疫功能起调制作 用。 本研究表明：假手术组血浆 -EP 和 ACTH 均有明显升高，提示手术创伤启动了机体 的自稳调节机制，致使 -EP 合成分泌，使 PHA 轴 ACTH 含量增加；而脑缺血再灌注大 鼠血浆 -EP 含量继续明显增高，而 ACTH 呈下降趋势，提示脑缺血再灌注模型机体免疫 功能紊乱抑制了 ACTH 的合成分泌，致使 PHA 轴功能紊乱，导致 -EP 与 ACTH 的比值 失调。 有研究认为 HPA 轴功能的紊乱是造成脑缺血再灌注后神经、内分泌、免疫系统紊乱的 关键环节，是加重缺血神经元损伤的重要物质基础 8。积极干预这个环节，是减轻脑缺血 再灌注后脑损伤，保护缺血神经元的重要途径之一。本研究结果表明：针刺 3h 介入 治疗可明显逆转 -EP 与 ACTH 的比值失调，调节紊乱的免疫功能。而 6h、48h 及药物组介入也可不同程度的逆转 -EP 与 ACTH 的比值失调，但远 远不及 3h 介入明显。 分析认为， 3h 早期介入针灸治疗可通过调节 HPA 轴的功能状态， 继而发挥其对细胞因子、血管内皮活性物质等的综合调节，达到调节神经-内分泌- 免疫网 络的失衡，提高机体的抗损伤能力，最终达到针灸的治疗目的。 4 结论 研究结果证明，-ET 与 ACTH 的比值失调是造成脑缺血再灌注损伤功能紊乱的关键 环节， “贺氏三通法”介入治疗可有效逆转其比值，进而达到治疗效应；且 3h 介入最为明 显。提示“贺氏三通法”是通过调节紊乱的免疫功能、重建机体的平衡状态达到抗炎、抗 损伤、保护脑功能的目的。 参考文献 1 Chalela JA，Alsop DC， Gonzalez-Atavales JB.et al.Magnetic resonance perfusion imaging in a cute ischemic stroke using continuous artierial spin labeling.S