丙型肝炎中p7蛋白

丙型肝炎病毒中 p7 蛋白的研究 摘要：p7 蛋白是一个介于丙型肝炎病毒(HCV) 结构蛋白和非结构蛋白之间的一 小蛋白，在脂质膜中形成六聚体阳离子通道，在病毒的自然感染过程中起一定的作用。 金刚烷胺和长烷基链的亚氨基糖衍生物可抑制 p7 形成的阳离子通道，从而对 HCV 的治疗发挥重要作用。本文就 p7 蛋白的基因组结构、合成与功能作一综述。 关键字：丙型肝炎病毒；p7 蛋白； 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus , HCV) 单股正链的RNA 病毒,全长为916 kb ,包括1 个大的开放阅读框(ORF) 和两侧的 5,3非编码区(UTRs)。核糖体通过进入HCV 5UTR 端的内部核糖体进入位点( IRES) ,将HCV基因组翻译成 1 个聚蛋白前体. 前体聚蛋白被宿主和病毒的蛋白酶共同 切割成为若干个具有独立功能的HCV 蛋白,根据功能的不同分别命名为 C、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B ,它们不但在HCV 的生活史中 发挥着重要的作用,也影响着宿主细胞的信号传导、凋亡及物质代谢等一系列生化过 程. P7 蛋白的基因组结构与合成 p7 是一个小的疏水性多蛋白，包括 36 个氨基酸残基，编码基因位于结构蛋白 和非结构蛋白之间，是膜相关性的，定位在内质网内。他包括 2 个跨膜 螺旋，与 一小的带电细胞质环相连，其氨基和梭基端尾朝向细胞内质网腔。这一带电环为亲水 片段，p7 蛋白属于病毒孔道蛋白家族，在细胞膜内其同源寡聚体形成水相孔道，这 些蛋白最具特征性的代表是流感 A 病毒的 M2 通道 p7 通过与谷胧甘肤S转移酶 (GST )在大肠杆菌中的融合可获得高水平 的表达，二者之间被6 组氨(HIS)连接子 2 所分离形成 GSTHISp7 复合结构。通过透射电子显微所成像发现， GSTHIS p7 和裂解的近于天然 HISp7 均呈具有纬度的环状结构.。化学交联数据表明 p7 形 成五聚体或六聚体结构，Griffin et al 研究表明在 HepG2 细胞中,重组的 HCV p7 可交 联成六聚体，在体外大肠杆菌表达的 p7 亦可形成六聚体。 p7 蛋白的功能 p7 蛋白是膜定位蛋白。在 HCV 基因组中，p7 是相对分子质量( Mr) 最小的病 毒蛋白。研究证实，HCV 前体蛋白的加工在宿主细胞内膜系统上进行，膜的定位作 用对非结构蛋白的加工成熟尤为重要 4。非结构蛋白 C-末端通过 NS5B C-末端疏水 -螺旋定位在内质网膜上 5，而 N- 末端则是通过 NS2 与 p7 蛋白结合，直接被定 位在内质网膜上。因此，p7 蛋白的膜定位作用很可能是非结构蛋白加工成熟的前提 条件。D.Agostino 等人 6的研究也证实, 包括 p7 蛋白在内的许多致瘤病毒蛋白都能 与细胞内膜相互作用。p7 蛋白 14 区和 9 区 - 螺旋结构是膜定位区, 两次跨膜将 p7 蛋白锚定在内质网膜上。尽管构成 A- 螺旋结构的氨基酸存在广泛的变异性 , 但其 中个别保守氨基酸对保持跨膜结构的稳定, 起到了重要作用 7。 15 区是 3 个氨基酸组成的保守环结构, 具有离子通道活性, 这种活性可被抗病毒药物金刚烷 抑制 8。 Griffin 等人 9的研究证实, 融合表达的 p7 蛋白在 HepG2 细胞内可以形成六聚体, 六聚 体围成了离子通道, 这个离子通道是由单体中 K-G-R 3 个氨基酸的侧链基团围成。同样的结论也 在人工生物膜上得到证实。 p7 蛋白还决定病毒的感染力。Sakai 等人 10用 HCV1a/2a 重组的 p7 蛋白病毒 感染黑猩猩, 发现这种嵌合病毒丧失了感染性, 因此推测, p7 蛋白在病毒的感染过程 中可能与基因组的其他区域发生了特异性作用, 包括 5-UTR 以及 C、E、NS2 等蛋 3 白。对 KGR 基序中的碱性氨基酸突变表明, 突变将导致病毒丧失感染能力。与 HCV 同属的 BVDV 病毒的 p7 蛋白研究也发现, p7 蛋白与病毒 RNA 的复制没有 相关性, 但用细胞培养系统进行病毒扩增时, p7 蛋白却是不可缺少的 8。这些现象都 说明, p7 蛋白不影响 HCV 基因组的复制, 但参与了 HCV 感染细胞的过程。 丙型肝炎病毒 P7 蛋白体外原核表达状况 设计扩增全长HCVP7 基因片段的特异引物，以H/FL 质粒DNA（含HCV1acDNA全长 序列）为模板，通过PCR 扩增全长HCVP7 基因，定向克隆到pQE30、pGEX4T- 2、pET32a（+）3 种不同类型的原核表达载体中。将重组后包含HCVP7 基因的原核表 达载体转化表达型大肠杆菌BL21（DE3）pLysS 或 SG13009（PREP4），并做异丙基硫 化- D- 半乳糖苷（Isopropyl- beta- D- thiogalactoside，IPTG）诱导表达， 通过SDS- PAGE 和Western blot 鉴定HCV P7 蛋白原核表达的情况。 HCV p7蛋白反式调节基因p7T P2的克隆化及生物信息学分析 应用PCR技术从HepG2细胞提取的cDNA扩增p7TP2基因，选用pGEMT载体进行 TA克隆，通过PCR，限制性酶切分析及测序进行鉴定。再将其亚克隆到真核表达载体 pcDN硝M31mycHis A，通过PCR，限制酶切分析进行鉴定，并应用生物信息学 初步分析其物理化学性质、蛋白质结构域、功能及染色体定位。结果：成功从HepG2 细胞提取的cDNA中扩增出p7TP2基因，编码区为495核苷酸(nt)，编码产物为164氨基 酸残基(aa)，经核苷酸序列数据库(GenBank)同源序列的搜寻，与已知基因序列和蛋 白序列之间没有显著同源性，属于未知功能新基因，并成功进行TA克隆，酶切、测 序均正确，并进一步亚克隆至pcDNA31mvcHis A真核表达载体，生物信息学 分析此基因位于8q243，必17 1465，理论pI ：926，半衰期为30 h(体外哺乳 4 类网状细胞)，属于不稳定蛋白，疏水指数较高，含有潜在的三个螺旋区域，四个B 折叠，四个蛋白激酶C磷酸化位点，一个酪蛋白激酶磷酸化位点，5个N肉豆蔻酰 位点，预测可能为具有不紧密的球蛋白结构。具有信号肽及两个跨膜结构域 p7 蛋白 丙型肝炎病毒潜在抑制靶点 HCV p7 蛋白是63 个氨基酸的疏水性蛋白。Lin等人122用带标签的融合蛋白, 证实p7 蛋白介于E2和NS2 之间。p7 蛋白N-端序列分析表明, p7 蛋白始于747 位, 并在E2 C-端疏水区引导下定位于质网膜, 终止于809 位。由于宿主信号肽酶对E2- p7 和p7-NS2 裂解存在活性差异, p7-NS2 ( 809P810AA) 比E2-p7( 746-747AA) 位 点更容易断裂, E2-p7 降解不完全, 因此常见E2 和E2-p7 两种稳定的形式。不像病 毒其他蛋白可在转录同时或转录后立即被降解, E2-p7-NS2 降解发生延迟, 因此常 能检测到E2-p7-NS2的存在132。E2-p7 ( 746 747AA) 和p7-NS2 ( 809P810AA) 切 点附近的氨基酸比较分析证实, 两处的氨基酸具有高度的保守性, 其中E2-p7 酶切 位点N-末端氨基酸为A-L-E, p7-NS2 位点C-末端氨基酸为AY-A。 筛选HCV p7蛋白反式调节基因 应用基因芯片技术：以含有HCV全基因组的pBRTM质粒作为模板，应用聚合酶 链反应（PCR）扩增p7蛋白编码基因片段，以常规的分子生物学技术构建表达载体 pcDNA3.1（）-p7。以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总mRNA，逆 转录为cDNA，与转染空白表达载体pcDNA3.1（）的HepG2细胞进行DNA芯片分析并 比较。 应用抑制性消减杂交技术：以HcV p7表达质粒pcDNA31(一)一p7转染HepG2 细胞，以空载体pcDNA31(一)为对照；制备转染后的细胞裂解液，从中提取n1RNA并 5 合成cDNA，经Rsa I酶切后将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再 与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与TA载体连接，构建 cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PcR后进行测序及同源 陛分析 p7 蛋白与 HCV 的治疗 HCV 感染世界上 3 %的人群，在西方是肝移植的主要指征，急性感染常是 无症状的，在大多数患者可持续导致慢性。HCV 抗病毒的治疗局限在 1 型干扰素(长 效干扰素) 或联合病毒唑、核昔类似物拉米夫定等，这一治疗方案是昂贵的，很少患 者可以接受，且只对 50%的患者有效.在病毒基因型中，经常出现治疗耐药。由于在 体外不能成功培养病毒，使的疫苗和新治疗方法研究受到阻碍。所有这些使的对 HCV 离子通道 p 7 的靶向抗病毒治疗显得尤为重要.对与 p 7 离子通道蛋白同一家族 流感病毒 A 的 M2 孔道的研究发现：金刚烷胺是第一个抗病毒药物。 展望 p7 蛋白是HCV 基因组中最小的蛋白, 长期以来对其功能知之甚少, 它既不是 结构蛋白, 又难归于非结构蛋白。近几年的研究不仅认识了p7 蛋白结构和细胞定位, 而且还发现了它的部分生物学功能。无论是对前体蛋白的定位, 还是离子通道作用, 或是参与病毒的感染过程, 这些功能都会影响到HCV 生活周期。因此, 对p7 蛋白深 入研究可为阻断p7 蛋白的离子通道活性、破坏其膜定位、抑制其与病毒前体蛋白其 他区域以及UTR 的相互作用等找到答案,从而探索出抑制HCV 新途径。p7 蛋白可能成 为新的抗病毒靶点。 参考文献 6 1.成军;李克;陆荫英;董菁,李莉,王琳,钟彦伟丙型肝炎病毒调节基因区结合的研 究期刊论文-世界华人消化杂志2002(2) 2.成军慢性病毒性肝炎发病机制的分子生物学研究期刊论文-世界华人消化杂 志 2002(2) 3.成军慢性丙型病毒性肝炎肝脏脂肪变的机制及其意义期刊论文-世界华人消 化杂志 2002(9) 4.刘妍;杨倩;成军基因表达谱芯片筛选NS5ATP3转染细胞差异表达基因期刊论文- 世界华人消化杂志 2004(2) 5.李克;王琳;成军酵母双杂交技术筛选克隆HCV核心蛋白结合蛋白基因1期刊论 文-世界华人消化杂志 2001(12) 6.Majumder M;Steele R;Ghosh AK;Zhou XY, Thornburg L, Ray R, Phillips NJ, Ray RB Expression of hepatitis C virus non-structural 5A protein in t