快速测定半胱氨酸含量方法的研究

毕 业 论 文 2014 届 快速测定半胱氨酸含量方法的研究 学生姓名 卓芸芸 学 号 10114339 系 别 化学化工学院 专业班级 药学 102 指导教师 边可君 完成日期 2014 年 5 月 16 日 快速测定半胱氨酸的含量方法研究 摘 要 钙黄绿素是一种具有荧光性的物质，在 pH 8.0 的 KH2PO4-NaOH 缓冲液中， Cu( ) 与钙黄绿素配位引起荧光猝灭。由于半胱氨酸与 Cu( ) 的亲和力较强， 可从钙黄绿素-Cu( ) 的络合物中夺取 Cu( ) 而使钙黄绿素游离出来，从而 使体系的荧光得以恢复，并且荧光恢复的程度与加入半胱氨酸的量在一定范围 内呈线性，从而可以测定半胱氨酸的含量。本实验在钙黄绿素与铜离子 1:1， 体系时间 30min 后，激发光谱 493nm，发射光谱 510nm 下进行测定，该法的回 归线性方程为：y=22.475x-64.1 r 为：0.34% 回收率为： 101.9%。 关键词 半胱氨酸；钙黄绿素-铜配合物；荧光光度分析方法 I Study on the method of rapid determination of cysteine content ABSTRACT Calcein is a fluorescent substance, KH2PO4 - NaOH in pH 8.0 buffer, Cu () and calcein ligand fluorescence quenching.Due to cysteine and Cu () affinity is very strong, can from the calcein - Cu () win Cu complex () and make the calcein freed,So that the system of fluorescence was restored, and the degree of fluorescence restoration and the quantity of adding cysteine in a certain range is linear.So that it can determine the content of cysteine.This experiment in the calcein with copper ions 1:1,System time after 30 min,Excitation spectrum 493 nm,Emission spectrum determination under 510nm,The method for the return of the linear equation :y=22.45x-63.6, r:0.34%,The recovery rate of:101.9%. KEY WORDS cysteine ; Calcein - copper complexes ; Fluorescent photometric analysis method II 目 录 摘 要 .I ABSTRACT .II 目 录 III 1 绪论 1 1.1 常见的测定方法 1 1.1.1 HPLC 法测定半胱氨酸的含量 1 1.1.2 分光光度法测定半胱氨酸的含量 1 2 实验部分 .5 2.1 仪器、药品、试剂 .5 2.2 实验步骤 .5 2.2.1 储备溶液配制 5 2.2.2 体系的激发和发射光谱 5 2.2.3.钙黄绿素及铜离子浓度比对荧光强度的影响 .6 2.2.4 缓冲溶液 pH 对荧光强度的影响 6 2.2.5 反应时间对荧光强度的影响 .6 2.2.6 标准曲线的绘制及线性关系考察 6 2.2.7 精密度实验 7 2.2.7 回收率实验 7 2.2.8 样品半胱氨酸含量的测定 7 3 实验结果与讨论 .7 3.1 磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液的配制 .7 3.2.2 缓冲溶液 pH 对荧光强度的影响 .9 3.2.3 反应时间对荧光强度的影响 10 3.2.4 半胱氨酸标准曲线 11 3.2.5 钙黄绿素及铜离子浓度比的选择 12 3.2.7 回收率的测定 13 3.2.8 样品溶液的测定 14 III 4 结论 .14 致 谢 .17 1 绪论 半胱氨酸为含硫氨基酸，结构式 HSCH2CH (NH2 ) COOH，半胱氨酸含有巯 基(- SH) ，胱氨酸含有二硫键 (- S- S- ) ，二者可以相互转变，蛋白质中两个半 胱氨酸残基之间形成的二硫键对维持蛋白质的结构具有重要作用 1，基于其独 特的结构，在动物体内起着营养和免疫相关的重要生理功能。此外，半胱氨酸 有刺激前 T 淋巴细胞分化为成熟的淋巴细胞的作用及增加人体对某些毒素的抵 抗力。 目前国内外检测半胱氨酸的方法有很多，已报道的测定半胱氨酸的方法有 电化学法 2、流动注射化学发光法 3、催化动力学分光光度法 4、旋光度法 5、 高效液相色谱法 6及荧光分光光度法 7等。 1.1 常见的测定方法 1.1.1 HPLC 法测定半胱氨酸的含量 高效液相色谱也叫高压液相色谱，是在经典液相色谱法的基础上发展起来 的，它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高效性，但 会引起高阻力，需用高压输送流动相，故具有分析速度快的优点。 王洋等 8采用高效液相色谱法来测定蛋白质粉中 L-半胱氨酸的含量。采用 色谱柱为 Agilent ZORBAX SB-C18，流动相为 0.1磷酸（pH 2.05）-乙腈 （80 20） ，检测波长为 210 n m，流速为 0.6 m Lmin1 ，柱温为室温。结果： L-半胱氨酸检测浓度线性范围为 0.021.0 mgm L1 （r0.9990） ，平均回收率 为 98.76，RSD1.82，检测限为 0.01 mgm L1 （S/N3 ） 。本方法操作简 便，结果准确可靠，重复性好，可用于蛋白质粉中 L-半胱氨酸的含量测定。 1 1.1.2 分光光度法测定半胱氨酸的含量 分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光 度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。 1.1.2.1 以 Cu2+为探针-分光光度法测定半胱氨酸的含量 9 在 pH4.0 的乙酸盐缓冲溶液中，半胱氨酸中的巯基（ SH）能使 Cu2+还原 成 Cu+，生成的 Cu+与 SCN-反应生成 CuSCN 沉淀，所得 Cu2+的量为定量生成 CuSCN 沉淀后留存的过量 Cu2+的量，将此 Cu2+的测定值间接换算成试样中半 胱氨酸的含量。溶液的吸光度和半胱氨酸的质量浓度在在一定范围之间呈线性 关系。 1.1.2.2 以钴离子为探针-分光光度法测定半胱氨酸的含量 10 由于 Co2+的高自旋态和有色性，作为生物体系中光谱探针是非常有利的。 在 NH4Cl-NH4OH 缓冲溶液中，Co 2+与半胱氨酸能形成稳定的高灵敏度络合物， 在紫外区有特征吸收，于 284nm、358 nm 处测其吸光度。实验条件下的半胱氨 酸与 Co2+ 的结合比及稳定性与反应时浓度有关，Co 2+过量于半胱氨酸或半胱氨 酸过量于 Co2+ 生成不同结合比的络合物，其稳定常数也不同，所测得的吸光 度也不同。以此建立了测定半胱氨酸分光光度分析方法。方法简便、快速，具 有较高灵敏度和较好的选择性。 1.1.2.3 邻二氮菲- 铁( ) 分光光度法测定半胱氨酸的含量 11 邻二氮菲Fe 3 +氧化体系的应用，研究了邻二氮菲铁( )与半胱氨酸的 反应，发现其产物为稳定红色螯合物，可用间接光度法定量测定反应物中的半 胱氨酸。其产物吸光度值符合朗伯比耳定律。采用本法测定谷氨酸、赖氨酸、 半胱氨酸混合试样中半胱氨酸含量，相对标准偏差2% ，结果令人满意。 1.1.2.4 亚硝酰铁氰化钠分光广度法测定半胱氨酸的含量 12 亚硝酰铁氰化钠与半胱氨酸的巯基在氨性条件下反应， 产生特征的酒红色， 其颜色与吸光度的关系符合朗伯比尔定律.该法灵敏度高，选择性好，干扰 少，适用于复杂样品中半胱氨酸含量的测定。 1.1.3 旋光度测量法测定半胱氨酸的含量 当平面偏振光通过含有某些光学活性物质的液体或溶液时，能引起旋光现 象，使偏振光的振动平面向左或向右旋转，偏振光旋转的度数称为旋光度。旋 2 光度测定法就是利用平面偏振光通过含有某些光学活性物质的液体或溶液时发 生的旋光现象来测量药物或检查药物的纯杂程度的方法，也可用来测定含量。 由于 L 2 半胱氨酸有不对称碳原子，当偏振光通过时发生偏振面的旋转，因 此具有旋光性。而偏振面的旋转角度与溶液的浓度成正比，所以我们利用这一 性质配制一系列标准浓度 L 2 半胱氨酸的溶液来测其旋光度， 这样就可以得出 一条旋光度对浓度的标准工作曲线，只要测其样品的旋光度就可以从标准曲线 上找出其相应的含量 13。L-半胱氨酸含量测量方法中，旋光度法和吸光度法最 简便准确，在无其他旋光性物质的体系中，可以选用旋光度法；若体系中有其 他旋光性物质，可以选用吸光度法测量 L-半胱氨酸的含量。 1.1.4 荧光光谱法测定半胱氨酸 荧光光谱分析法是根据物质的荧光谱线的位置及其强度进行物质鉴定和含 量测定的仪器方法。 廖文生 14等利用钛铁试剂- 铜配合物荧光光谱法测定半胱氨酸。在 pH 8. 0 的 B - R 缓冲溶液中 L -半胱氨酸与钛铁试剂 - 铜配合物的作用，当半胱氨酸的 加入导致钛铁试剂-铜配合物在 350 nm 处的荧光显著增强，并且在一定浓度范 围内体系荧光强度的增大与半胱氨酸浓度呈良好的线性相关性，据此建立了一 种测定半胱氨酸的新方法。 1.1.5 流动注射荧光法测定药物中半胱氨酸的含量 流动注射荧光光谱法 15是荧光光谱法和流动注射技术联用的一种新的分析 方法。在近中性介质及聚乙烯醇(PVA) 存在下，半胱氨酸能熄灭一个新的荧光 试剂 5 - (4 -氯苯基) - 8 -苯磺酰氨基喹啉(CPBSQ) 与 Cu( II) 络合体系的荧光的 反应。其原理为：CPBSQ 与 Cu( II) 络合体系产生荧光络合物，而半胱氨酸可 将 Cu( II)还原成 Cu ( I)，从而使体系的荧光熄灭。基于此现象建立了一个简单、 快速、灵敏和选择性的测定半胱氨酸的流动注射荧光方法.。 1.1.6 原子吸收光谱法间接测定半胱氨酸的含量 原子吸收光谱法是利用气态原子可以吸收一定波长的光辐射，使原子中外 层的电子从基态跃迁到激发态的现象而建立的。由于各种原子中电子的能级不 同，将有选择性地共振吸收一定波长的辐射光，这个共振吸收波长恰好等于该 原子受激发后发射光谱的波长，由此可作为元素定性的依据，而吸收辐射的强 3 度可作为定量的依据。 刘文涵 16等利用新生成的 ZnS 悬浮液与半胱氨酸在碱性条件下，反应生成 可溶性半胱氨酸锌络合物，离心分离后用塞曼原子吸收光谱测定溶液中的锌质 量浓度即可间接的得到半胱氨酸的含量，研究选择了原子吸收间接测定半胱氨 酸的最佳条件和方法，在 pH 9.70 的 2% 硼砂底液中于室温下使半胱氨酸试液 与新生成的 ZnS 悬浮液反应。 1.2 本文研究目标 荧光猝灭是指荧光物质分子与溶剂分子之间发生猝灭，荧光猝灭分为静态 淬灭和动态猝灭。利用某种物质对某一种荧光物质的荧光猝灭作用而建立的对 该淬灭剂的荧光测定方法，即为荧光淬灭法。随着科学技术的不断创新，荧光 淬灭法越来越重要，必将应用于更多科学领域。 本文通过钙黄绿素是一种具有荧光性的物质，Cu( ) 与钙黄绿素配位引起 荧光猝灭。继而探索半胱氨酸的加入对体系的影响，并进行优化实验来探究最 佳实验条件。 2 实验部分 2.1 仪器、药品、试剂 F-4500 荧光分光光度仪（日立） 电子天平（AL204，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司） 数显 pH 计（雷磁 PHS25） 半胱氨酸标准品（浙江方强制药厂有限责任公司） 半胱氨酸待测品 (浙江京新药业股份有限公司) 其他分析试剂（CuSO4，钙黄绿素，磷酸二氢钾，氢氧化钠）均产自国产 4 2.2 实验步骤 2.2.1 储备溶液配制 钙黄绿素储备溶液(1.010 -3mol /L) :称取 0.3287g 钙黄绿素固体，加 0.1 mol/L 的 NaOH 溶液 25mL 溶解后，转入 500 mL 的容量瓶，水定容，4保存， 使用时再用水稀释至所需浓度。 硫酸铜储备溶液（1.010 -5mol /L）：称取 0.0288g 于烧杯中加水溶解，转 移至 100ml 容量瓶，定容配成 1.010-3 mol /L 硫酸铜溶液，取 1 毫升 1.010-3 mol/L 硫酸铜至 100 容量瓶定容，稀释成 1.010-5 mol/L 硫酸铜溶液。 半胱氨酸储备溶液（1.010 -3 mol/L）：称取半胱氨酸标准样品 0.012g，用 蒸馏水溶解并定容至 100ml，配成 0.001mol/L 的水溶液。再移取一毫升的半胱 氨酸，用蒸馏水溶解并定容至 100ml，配成 1.010-5 mol /L 的标准溶液。 磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液的配制：移取氢氧化钠 5 毫升，在移取一系 列的磷酸二氢钾从而配的不同 pH 的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液。 2.2.2 体系的激发和发射光谱 固定激发波长，扫描钙黄绿素溶液得到其发射光谱；固定发射波长，扫描 钙黄绿素溶液，得到其激发光谱，从而确定其最大发射光谱和最大激发波长。 2.2.3.钙黄绿素及铜离子浓度比对荧光强度的影响 分别测定 nCu2+:n钙黄绿素=1:1，1:2，2:1 时的荧光值，以荧光强度对 nCu2+:n钙黄绿素作图。 2.2.4 标准曲线的绘制及线性关系考察 精密称取半胱氨酸标准样品0.012g，用蒸馏水溶解并定容至100ml，配成 0.001mol/L的水溶液。再移取一毫升的半胱氨酸，用蒸馏水溶解并定容至 100ml，配成1.010 -5 mol /L的标准溶液。于一系列 25ml容量瓶中，分别依次加 入0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml 1. 0 10-5 mol /L半胱氨酸标准溶液，5.0ml 1.010-5 mol /L钙黄绿素分析液，5.0ml 1.010-5 mol /L CuSO4标准溶液后，用 5 pH8.0的KH 2PO4-NaOH缓冲液定容至刻度，放置 20min后，以493nm 为激发波长， 510nm为发射波长，测定溶液的相对荧光强度，绘制标准曲线，得线性回归方 程及相关系数。 2.2.5 缓冲溶液 pH 对荧光强度的影响 配置不同pH值的KH 2PO4-NaOH缓冲液，分别加入铜离子与钙黄绿素的浓度 均为1.010 -5mol/L各5ml，再用缓冲溶液定容至刻度。待体系稳定后测定其荧光 值。 2.2.6 反应时间对荧光强度的影响 在 pH8.0 的 KH2PO4-NaOH 缓冲液中，分别加入铜离子与钙黄绿素的浓度 均为 1.010-5 mol /L 各 5ml，用缓冲溶液定容至刻度。在一定的激发波长和发射 波长下，在 30min 前每隔 5min 测定钙黄绿素-铜体系的荧光强度，30min 后每 隔 15min 测定一次，一直到体系稳定为止。 2.2.7 精密度实验 于 25mL 比色管中，分别加入 2ml，4ml，6ml 1. 0 10-5 mol /L 半胱氨酸标 准溶液，5.0ml 1.010-5mol /L 钙黄绿素分析液，5.0ml 1.010-5 mol /L CuSO4 标 准溶液后，用 pH8.0 的 KH2PO4-NaOH 缓冲液定容至刻度，放置 20min 后，以 493nm 为激发波长，510nm 为发射波长，测定溶液的相对荧光强度平行测定 3 次，求得 RSD。 2.2.8 回收率实验 为了验证方法的准确性，精密称取已知含量的半胱氨酸适量，加入一定量 的半胱氨酸对照品，按实验方法制成样品样，测定其含量，计算回收率。 6 2.2.9 样品半胱氨酸含量的测定 称取一定量的半胱氨酸样品，用蒸馏水定容至 250mL。再按上述方法制 备样品液，测定半胱氨酸的相对荧光强度，再用回归方程求取半胱氨酸的含量。 3 实验结果与讨论 3.1 磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液的配制 表 3-1 磷酸二氢钾氢氧化钠缓冲溶液的配制 PH(20) X(毫升) Y（毫升） 6.01 5 0.570 6.80 5 2.963 7.29 5 4.280 8.00 5 4.480 8.20 5 4.700 3.2 荧光化合物的发射和激发光谱 按 2.2.2 项下方法，在 200700nm 波长范围内分别对钙黄绿素液，钙黄绿 素-铜混合溶液进行发射波长和激发波长的扫描。所得发射及激发光谱见。 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 0 100 200 300 400 500 600 系 列 1 图 3-1 钙黄绿素激发光谱 7 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 0 100 200 300 400 500 600 图 3-2 钙黄绿素铜混合液的激发光谱 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 系 列 1 图 3-3 钙黄绿素的发射光谱 图 1 钙 黄 绿 素 及 钙 黄 绿 素 -铜 配 合 物 的 激 发 光 谱 与 发 射 光 谱 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 200 300 400 500 600 700 800 F 不 加 铜 离 子 加 入 铜 离 子 图 3-4 钙黄绿素及钙黄绿素-铜配合物的发射光谱 8 由图可见，激发波长493nm，发射波长510nm的条件下，钙黄绿素与铜配 合能发生较好的荧光猝灭。所以本实验选择493nm 为激发波长，510nm 为发射波 长。 3.3 钙黄绿素及铜离子浓度比 n 的选择 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 n F值 （5 10n m） 图 3-5 钙黄绿素及铜离子浓度比 n 对荧光值的影响 3.4 半胱氨酸标准曲线 F0=1246 y = 22.475x - 64.1R2 = 0.9924 050 100150 200250 300350 400450 0 5 10 15 20 25 C半 管 氨 酸 （ 10-7mol/L） F 值（ 510 nm） 图 3-6 半胱氨酸的标准曲线 所得数据经回归处理，测定的标准曲线为：Y=22.475x 64.1 其中Y 为相对 荧光强度，X为半胱氨酸的浓度（10umol/L） 。相关系数r=0.9926。 结果表明： 9 在4 - 20(10umol/L)范围内，半胱氨酸浓度与荧光强度呈良好线性关系。 3.5 缓冲溶液 pH 对荧光强度的影响 结果如下表所示。 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 5 6 7 8 9 图 3-7 缓冲溶液 pH 的影响 由图可知，在酸性条件下相对荧光强度较强，随着pH 的增大，荧光值逐渐 下降，再增大时pH又随之增大。 3.6 反应时间对荧光强度的影响 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 0 10 20 30 40 50 60 70时 间 （ min） F 值（ 510 nm） 图 3-8 反应时间对荧光强度的影响 由图可知，随着反应时间的增加，相对荧光强度逐渐减弱。但在反应 25 分 10 钟后，相对荧光强度变化较平缓，基本反应完全。所以，选取最佳反应时间为 30 分钟。 3.7 精密度实验 从半胱氨酸标准液中精密吸取2mL，4mL，6mL到25mL比色管中，按标准 曲线下操作，测定样品中半胱氨酸的荧光强度（平行测定3次）。结果见表 表 3-2 精密度实验 实验号 荧光强度 测定值（umol/L） 百分含量（ %） 平均值（ %） RSD（%） 1 1355 0.77 96.12 2 1359 0.79 98.42 3 1357 0.78 97.11 97.22 0.907 4 1539 1.59 99.18 5 1542 1.60 100.11 6 1542 1.60 99.99 100.10 0.362 7 1701 2.31 96.22 8 1699 2.30 96.18 9 1701 2.31 96.23 96.21 0.250 从由上表可知，半胱氨酸的平均百分含量为 97.22%，100.10%，96.21% ，RSD分别为0.907%，0.362%，0.250%，说明本实 验方法精密度好。 3.8 回收率的测定 精密称取已知含量的半胱氨酸标准品适量，配成溶液。加入一定量的半胱 氨酸对照品于25mL比色管中，按上述方法配成溶液后，再按上述实验步骤测得 其荧光值，同上述含量测定方法测定半胱氨酸标准品含量，计算回收率。其结 果见表 表 3-3 回收率实验 实验号 标准样(umol) 加入量(umol) 测定值(umol) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 11 1 0.0295 0.0112 0.0410 103.0 2 0.0295 0.0112 0.0409 102.0 101.9 1.03 3 0.0295 0.0112 0.0408 100.9 实验结果表明：半胱氨酸的平均回收率为101.9%，RSD为1.03%。 3.9 样品溶液的测定 从样品液中精密吸取0.1mL到10mL比色管中，按实验方法测定样品中半胱 氨酸的荧光强度，用回归方程求取含量。其结果见表。 表 3-4 片剂中半胱氨酸含量 试验号 荧光强度 测定值（mg/10mg） 百分含量% 平均值（%） RSD（%） 1 2061 4.77 47.73 2 2023 4.75 47.48 47.67 0.34 3 2069 4.78 47.79 结果分析：10mg片剂中的平均含量为4.77mg，平均百分含量为47.67%，其 RSD为 0.34%。 4 结论 在激发波长493nm，发射波长510nm的条件下，钙黄绿素与铜能发生较好的 荧光猝灭。所以本实验选择493nm为激发波长，510nm为发射波长。 查文献得知，Cu 2+与钙黄绿素比例的不同，则体系的背景信号也会不同。 在pH8.0的KH 2PO4-NaOH缓冲液中，Cu 2+与钙黄绿素的浓度为1. 010 -5 mol /L时， Cu2+与钙黄绿素的比例不同，测得体系的荧光值也会不同，当Cu 2+与钙黄绿素 的物质的量之比小于1:1时，当铜离子的量加大后，溶液的荧光会迅速下降，但 此体系背景信号程度过低，因为对于此体系，钙黄绿素相对来说是过量，铜离 子含量相对不足，即原体系荧光度一直很强，对于之后的半胱氨酸的加入，则 对原体系影响不大。当铜离子与钙黄绿素的物质的量之比大于1:1 时，溶液的荧 光猝灭程度趋于平缓，对于此体系，铜相对来说是过量的。由于铜离子与半胱 12 氨酸的结合度比铜离子与钙黄绿素的结合度要牢固，故若溶液中存在过量的铜 离子，部分半胱氨酸将首先与过量的铜离子反应，而不是去夺取钙黄绿素-铜离 子配合物中的铜离子，因此测定的灵敏度将降低。故本实验选取的体系为铜离 子与钙黄绿素之比为1:1。 在实验标准条件下，以半胱氨酸标准品与荧光强度绘制标准曲线，得出线 性回归方程：y=22.475x-64.1 ，相关系数 r 为 0.9926。改变反应的条件 pH，来 探究对荧光值的影响，得出在酸性条件下相对荧光强度较强，随着 pH 的增大， 荧光值逐渐下降，再增大时 pH 又随之增大。分析这是由于 当 pH 值偏小时，铜 离子与钙黄绿素的结合程度不牢固，即溶液中游离的钙黄绿素较多，所以此时 的荧光值较大，随着 pH 值的升高，钙黄绿素与铜的结合程度越来越牢固，故 荧光值逐渐下降，但当 pH 偏过高时，OH -1 会和 Cu2+结合，使溶液中游离的钙 黄绿素又增大，则荧光值又升高，由表可知，pH 为 8.00 处时为最佳 pH 值。探 究反应时间对荧光值的影响，得出随着反应时间的增加，相对荧光强度逐渐减 弱，但在反应 25 分钟后，相对荧光强度变化较平缓，基本反应完全，所以，选 取最佳反应时间为 30 分钟。 最后利用荧光猝灭法对片剂中半胱氨酸的含量进行测定。设置激发波长为 493nm，发射波长为510nm，测得片剂中半胱氨酸的含量为47.67%，RSD为0.34% ，平均回收率为101.9%，RSD为0.34%。 参考文献 1李爱玲，高兰兴. 氨基酸对心血管功能的影响，J .氨基酸和生物资源，1998 ， 20 (2) :4546. 2Hsiao Y，Su W，Cheng J，et al. 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