医学课件微生物药物的生物合成微生物新药的发现

微生物药物的生物合成微生物药物的生物合成 微生物新药的发现微生物新药的发现 根据微生物药物的生物合成原理 发现微生物新药的方法和途径 n通过非基因定向改变、基因定向改变， 以及组合生物催化的技术，或是改变原 有微生物药物的生物合成途径，或是对 原有的微生物药物（或先导化合物和中 间体）进行生物催化，以发现微生物新 药 . 产生菌 前体物质 (1) 诱变处理 化学 修饰 天然产物 衍生物 天然产物 天然中间物 天然产物 衍生物 化学修饰 生物转化与 组合生物转化 阻断或非阻 断菌株 定向与杂交 生物合成 微生物或 酶转化 天然产物 类似物 杂合 工程菌 突变生物 合成 组合生物合成 (2) 基因操作 天然产物 类似物 (1) (2) 天然产物 类似物 微生物药物生物合成 与微生物新药发现的基本途径 n通过非基因定向改变的方法包括：定向 生物合成、杂交生物合成、突变生物合 成，以及生物转化与组合生物转化； n基因定向改变，即为组合生物合成。 第一节第一节 生物合成途径的非基因定向改变生物合成途径的非基因定向改变 与微生物新药的发现与微生物新药的发现 一、非遗传操作的定向生物合成 与微生物新药的发现 n已有的研究表明，在抗生素等次级代谢产物生 物合成中酶底物的特异性足以使结构相关的 代谢产物在其发酵液中积累； n但由于生物合成酶的底物专一性较低（宽泛性 ），其野生型菌株或阻断突变株的发酵过程中 添加一些已知结构类似物作为前体物质，可以 产生含有与这种已知结构类似的新衍生物； n这种获得新次级代谢产物的途径，可以被称之 为非遗传操作的定向生物合成 (directed biosynthesis)。 前体（precursor） n即在微生物培养过程中，外源添加的某 一化学物质，通过微生物的代谢，能够 将其整体地或部分地整合到某一特定的 次级代谢产物的分子中去的化合物，如 苯乙酸或苯乙酰胺及苯氧乙酸等）。 非遗传操作的定向生物合成 n这种在发酵过程中通过添加某种特定的前体物 质，使微生物的生物合成朝着将这些前体物质 掺入到产物分子的某一特定部位而产生过量的 含有这种前体的产物的方法，即为非遗传操作 的定向生物合成。 n其基本原理是由于参与这些反应的生物合成酶 的底物专一性较差，而能使外源添加的某些前 体物质竞争性地掺入到特定产物的分子中去。 定向生物合成与微生物新药的发现 n次级代谢产物合成酶的特点： 是一个由一系列酶参与催化的多酶体系 。 参与催化反应的酶的底物专一性比初级 代谢合成酶要差。 应用实例 n应用非遗传操作定向生物合成的方法能 够制备获得许多新的抗生素，其中目前 已进行工业化生产的有： n青霉素G和V； n培罗霉素； n四环素和金霉素等。 青霉素定向生物合成 . 序号侧 链 R学 名俗 名 1对羟基苄青霉素青霉素X 2苄青霉素青霉素G 3戊烯2青霉素青霉素F 4戊青霉素青霉素二氢F 5庚青霉素青霉素K 6丙烯巯甲基青霉素青霉素O 7苯氧甲基青霉素青霉素V 84氨基4羧基 丁基青霉素 青霉素N 青霉素和6APA分子结构及各种天然青霉素的结构与名称 青霉素分子的化学结构 6APA的化学结构 各种天然青霉素具有的侧链和名称 培罗霉素定向生物合成 . 培罗霉素定向生物合成 可结合进入BLM的末端胺基部分的非天然胺基化合物 . * PEP的末端胺基 四环类抗生素的定向生物合成 R5R6R7 6去甲基四环素HHH(1) 7氯6去甲基四环 素 HHCl(2) 四环素HCH3H(3) 5羟基四环素（土霉素 ） OHCH3H(4) 7氯四环素（金霉素）HCH3Cl(5) 微生物发酵产生的一些四环素类抗生素 四环类抗生素的定向生物合成 在生产金霉素时需添加氯化物作为前体 ，而当生产四环素时，则必须要在发酵 培养基中添加氯离子抑制剂，如溴化物 或M-促进剂等，从而抑制金霉素的合成 而得到四环素产物。 另外，用金色链霉菌在发酵的金霉素过 程中添加适量的甲基化反应抑制剂如磺 胺嘧啶钠，能够获得去甲基金霉素。 杜拉克丁的定向生物合成 杜拉克丁的定向生物合成 组分R1R2XY备注 A1a A1b A2a A2b B1a B2b B2a B2b OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OH OH OH OH CH=CH CH=CH CH2CH（OH） CH2CH（OH） CH=CH CH=CH CH2CH（OH） CH2CH（OH） 25-环环己烷烷基-B2 25-环环己烷烷基-B1 OH OH CH2CH（OH） CH=CH 外源添加环 己烷羧酸钠 非基因改变定向生物合成的研究进展 尽管近年来基因改变的定向生物合 成发展很快，但利用非遗传操作定向生 物合成原理寻找新的生理活性物质的研 究还在不少实验室继续进行，特别是对 一些肽类如环孢菌素A、aureobasidins 及糖肽类如替考拉宁产生菌的定向生物 合成研究取得了很大的进展。 二、添加外源酶抑制剂的杂交生物合成 与微生物新药的发现 n 杂交生物全成（hybrid biosynthesis）似乎可 以理解为是一种“强化”的非遗传定向生物合成 ，如在苦霉素产生菌生酵过程中添加聚乙酰途径 中-酮酯酰基合成酶抑制剂线兰菌素 (cerulenin)，使其失去合成链霉素大环内酯苷 元(picronolide)的能力而只能合成糖基。同时 在发酵过程中添加泰乐菌素大环内酯苷元 (protylonolide)，使其与苦霉素生产菌产生的 糖基结合，得到一种被称之为M4365G1的杂合抗 生素(hybrid antibiotic)。 杂交生物合成与微生物新药的发现 葡萄糖 1CH3COOH 6CH3CH2COOH 2CH3COOH 5CH3CH2COH CH3CH2CH2COOH S.fradia KA427 NO.261 Protylonolide Picronolide Desosamine Picromycin DDesosaminyl Protylonolide （M4365G1） 在浅蓝菌素存在下，用苦味霉素产生菌（S.sp.AM4900 ） 与protylonolide 杂交生物合成M4365G 杂交生物合成产物工业化的可能性 尽管通过杂交生物合成能够得 到一些新的抗生素，但由于所添加 的浅蓝菌素本身就是一种昂贵的抗 生素，再则所添加的苷元的结构受 到限制，所以这种方法似乎没有很 大的实际意义。 三、非定向诱变的突变生物合成 与微生物新药的发现 n突变生物合成（mutational biosynthesis） ： n突变生物合成是指野生型产生菌经化学或物理 等因素诱变处理后，丧失合成原来次级代谢产 物的能力而成为阻断突变株，然后在发酵培养 阻断突变株时添加某种外源物质，参与生物合 成以获得新的次级代谢产物的过程。 n另外，突变生物合成也包括由于突变而引起产 生新的次级代谢产物。 突变生物合成原理 阻断突变株的类型 营养缺陷型突变株： 由于编码菌体生长之必须的酶的基因发生了 突变，而使菌体不能生长，导致不能合成次 级代谢产物。因此，这类突变株也可以称为 初级代谢阻断突变株。 独需型突变株： 这种突变株的生长和初级代谢正常，但由于 编码次级代谢产物合成的某一基因发生突变 ，而使丧失了合成次级代谢产物的能力。这 是突变生物合成所需要的突变株。 双重阻断突变株： 即突变既发生在编码初级代谢酶的基因上， 也发生在编码次级代谢酶的基因上。 突变生物合成与微生物新药发现 . 野生型产生菌独需型突变株 AB 正常途径 某抗生素 阻断变株A阻断变株B AB + B A + AB A B A，B为某一抗生素分子结构的两个部分 AB为发酵液培养时阻断变株的代谢产物 B A 为发酵培养时添加的AB的结构类似物 AB A B 即为新的杂合抗生素 利用独需型突变株合成产生新抗生素的基本原理 突变生物合成的 基本流程 . 出发菌株的选择 诱变处理 阻断突变株筛选 琼脂块法选择 有生理活力的突变株无生理活力的突变株 摇瓶复筛 有生理活力的突变株 无生理活力的突变株 区段合成产物，连接 酶等生化特性的研究 有区段合成产物、无 连接酶等活性的突变 株 有区段产物A有连接 酶等活性的突变株 有区段产物B有连接 酶等活性的突变株 发酵培养 添加结构类似物A或B 样品收集 TLC、HPLC检测及制备 结构检测 突变生物合成产生的新抗生素 . 菌种抗生素特殊营营养增补补物新抗生素 伊尼奥小单孢单孢 菌西梭霉素DOS链链霉胺等突变变霉素1等 绛红绛红 小单孢单孢 菌庆庆大霉素DOS链链霉胺等2羟羟基GM等 红红霉素链链霉菌红红霉素Erythronolide8，8 deoxyoleanolie 未鉴别鉴别 弗氏链链霉菌新霉素DOS链链霉胍等杂杂交霉素A，B 加利利链链霉菌阿克拉霉素阿克拉酮酮紫红红霉酮酮等11羟羟基阿克拉霉 素A 灰色链链霉菌链链霉素紫红红霉酮酮等2脱氧链链霉胍streptomutin A 卡那霉素链链霉菌卡那霉素DOS1N甲基DOS等1N甲基GM等 雪白链链霉菌新生霉素氨基香豆氨基香豆素同系物未鉴鉴明 核糖苷链链霉菌核糖霉素DOS1N甲基DOS等1N甲基 RSMC等 普拉特链链霉菌普拉特霉素PlatenolideNarbonolide5O mycaminosyl narbonolide 龟龟裂链链霉菌巴龙龙霉素DOS链链霉胍杂杂交霉素C 巴龙链龙链 霉菌尼可霉素尿嘧啶嘧啶嘧啶嘧啶尼可霉素Z等 唐德链链霉菌 红霉素生物 合成途径 . 丙酮CoA 丙酰SACP 甲基丙二酰 甲基丙二酰SACP 丙酰丙酰SACP 聚酮体途径 6脱氧红霉内脂B 红霉内脂BTDPL碳霉糖 葡萄糖 TDPD葡萄糖 3O碳霉糖基红霉内脂TDP脱氧氨基己糖 红霉素D 红霉素C 红霉素A 红霉素E 红霉素B 缩合酶 突变株产生的 新蒽环类抗生素 . RR1R2 道若霉素（原株产生）OCH3COCH3OH 亚德里亚霉素（变株产生）OCH3COCH2OHOH 13双氢道若霉素（变株产生）OCH3CHOHCH3OH 13双氢洋红霉素OHCOCH3OH 11去氧道若霉素（变株产生）OCH3COCH2OHH 11去氧亚德里亚霉素（变株产生）OCH3CH2CH3H BaumycinA*（原株产生）OCH3CH2COCH3OH Feudomycin A（变株产生）OCH3CH2CH3OH Feudomycin BOCH3CH2COCH3OH 突变株产生的一些新的次级代谢产物 . 原菌种原抗生素突变株产生的新抗生素 普拉特链霉 菌 普拉特霉素demycarosyl普拉特霉素 9dehydromycarosyle普拉特 霉素 波赛链霉菌 紫产色链霉 菌 柔红霉素 烬灰红菌素 阿霉素 烬灰红菌素X 波赛链霉菌baumycinoxaunomycin 棘孢小单孢 菌 庆大霉素小诺霉素 生金链霉菌四环素去甲基四环素 生金链霉菌金霉素去甲基金霉素 龟裂链霉菌土霉素去甲基土霉素 吸水链霉菌carriomycincarromycinA 我国应用突变生物合成原理找到的小诺霉素 . 2H2SO4 庆大霉素和小诺霉素的化学结构 抗生素R1R2分子式 硫酸庆庆大霉素C1CH3NHCH3C21H43N5O72H2SO4 硫酸庆庆大霉素C1aHNH2C19H39N5O72H2SO4 硫酸庆庆大霉素C2CH3NH2C20H41N5O72H2SO4 小诺诺霉素HNHCH3C20H41N5O72H2SO4 四、原生质体融合与微生物新药的发现 微生物原生质体融合，即是指将双新株的微生 物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体 ，然后在高渗溶液的条件下混合，并加入物理 的（如电融合）或化学的(如聚乙二醇)或生物 的（如仙台病毒）助融条件，使双亲株的原生 质发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合， 尔后发生基因组间的交换，重组，进而可以在 适宜的条件下再生出微生物细胞壁，获得重组 子的过程。 四、原生质体融合与微生物新药的发现 n利用微生物厚生质融合寻找新抗生素的 基本原理是来源于两种已知产生不同抗 生素的产生菌的融合子，有可能将它们 的部分生物合成基因整合在一起而产生 新的杂合抗生素；另一个原理是由于抗 生素产生菌中存在着沈默基因，当这些 沉默基因受到外源物质刺激后，有可能 被激活而产生，结构与亲株完全不同的 新的抗生素。 四、原生质体融合与微生物新药的发现 应用这种方法获得的第一个新抗生素是 吲哚佐霉素（indloizomycin）： 其亲株为链霉素产生菌灰色霉菌和天神 霉素（istamycin）产生菌天神链霉菌 S.tenjimariensis。 （目前的报道较少） 第二节第二节 生物合成途径的基因定向改变生物合成途径的基因定向改变 与微生物新药的发现与微生物新药的发现 组合生物合成 Combinatorial biosynthesisCombinatorial biosynthesis 是是一种通过对天然产物生物合成途径中一种通过对天然产物生物合成途径中 的基因进行中断、置换及重组等操作，的基因进行中断、置换及重组等操作， 改变原来抗生素产生菌或其他天然产物改变原来抗生素产生菌或其他天然产物 产生菌生物合成代谢产物的途径，产生产生菌生物合成代谢产物的途径，产生 具有新颖结构的具有新颖结构的“非天然的天然杂合产非天然的天然杂合产 物（物（unnatural natural hybrid unnatural natural hybrid compoundscompounds）”的技术或方法。的技术或方法。 组合生物合成的潜能 potential n重组、组合、互补、替换 n R=可利用的基因 n=基因的等位 形式 n化合物数Rn n R=4, n=4 n Compounds=44=256 组合生物合成的原理 n 生物合成酶基因的结构和组成 n 生物合成酶基因的特异性及底物宽容 性 n 生物合成酶基因之间的相互作用 n 生物合成途径的研究基础 一、具有聚酮体生物合成途径的 微生物药物产生菌的组合生物合成 基于商业性的原因，迄今为止，对一些具有 聚酮体生物合成（polyketide synthases， PKSs）途径的“天然产物”，如红霉素、阿 维菌素、泰乐菌素、柔红霉素、阿克拉霉素 、西罗莫司和利福霉素等； 具PKS途径的抗生素 药物类别 化 合 物 大环内酯类抗生素 红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素 四环类抗生素 四环素、金霉素、土霉素 抗肿瘤抗生素 柔红霉素，阿克拉霉素、 enediynes 抗寄生虫药 avermectin，nemadectin 免疫抑制剂 FK506, rapamycin 抗真菌药 两性霉素，制霉菌素 心血管药物 lovastatin,，compactin 兽药莫能星（monensin），泰乐菌素 (tylosin)，盐霉素 1、红霉素产生菌的组合生物合成 通过操作PKS的模块中单个基因的组合生 物合成； 在非天然产物产生菌中过量表达组合生 物合成产物； 通过操作PKS模块之间连接的组合生物合 成 ； 通过操作脱氧糖途径基因的组合生物合 成。 红霉素产生菌的组合生物合成的可能性 n参与红霉素生物合成的PKSs，或6脱氧红霉 内酯合成酶（6-deoxyerythronolide B synthase，DEBS）有6个模块组成，每个模块 负责合成聚酮体中的一部分。 n由于各模块之间的协调性，以及每个模块编码 决定延伸单位的选择、功能和立体化学性质的 催化结构域，因此，就有可能通过对PKSs结构 域或模块的操作获得具有新颖结构的化合物。 n由于具有聚酮体结构的化合物其结构非常复杂 和具有众多的立体异构体，因而，难以用常规 的化学方法来获得。 红 霉 素 的 生 物 合 成 途 径 PKS中的每一个模块的组成 n酮基合成酶（ketosynthase，KS） n酰基转移酶（acyl transferase，AT） n酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP n-酮基修饰酶：包括酮基还原酶（ ketoreductase，KR）、脱氢酶（ dehydrogenase，DH）和烯酰还原酶（ enoylreductase，ER） nDEBS含有编码三个独立的多肽亚单位的6个模 块 n大多数典型的聚酮体合成途径的产物包括对 PKS产物的修饰，如将脱氧糖或氨基糖进行糖 苷化以及通过细胞色素P450进行氧化。图中所 示的LD为装载域（loading domains），TE为 硫酯酶（esterases）。 1）通过操作PKS的模块中单个基因的组合生物合成 一是用利福霉素PKS模 块2中的DH/ER/KR结构 域取代红霉素PKS模块 2中的KR； 二是将模块5中的KR缺 失； 三是用利福霉素模块2 中的丙二酰特异性 AT取代模块6中的甲基 丙二酰特异性的AT ），将得到一个发生 三重突变的PKS产物。 2）在非天然产物产生菌中过量 表达组合生物合成产物 n将E.coli 开发成能够表达PKS产物需要 解决的问题主要有三个方面： n一是能够功能性表达巨大的蛋白（ 330kDa）； n二是PKS亚单位的ACP结构域的翻译后磷 酸泛酰巯基乙胺酰化； n三是聚酮体途径中的前体物质，特别是 （2S）甲基丙二酰CoA在E.coli中不 存在。 Pfeifer等的工作包括： n运用来源于枯草芽孢杆菌非核糖体多肽合成酶 （NRPS）基因簇的磷酸泛酰巯基乙胺酰转移酶 （phosphopantetheinyl transferase）基因 sfp，以对PKS亚单位的ACP结构域的翻译后磷 酸泛酰巯基乙胺酰化； n过量表达E.coli中的丙酰CoA合成酶基因 prpE，扰乱丙酰CoA代谢途径，以及过量表 达来自S.coelicolar的丙酰CoA羧化酶基因 pcc，使丙酰CoA转化为（2S）甲基丙二酰 CoA 3）通过操作PKS模块之间连接的组合生物合成 n通过对DEBS模块在E.coli和体外的表达研究， 发现在PKS装配过程中那些短的模块内和多肽 内的“连接件”是至关重要的成分。研究发现 在相继非共价连接的模块中，其氨基和羧基末 端存在有多肽内连接件，这种连接件与单个多 肽内的模块之间的连接件不同。 n因此，使用一种合适的连接件就有可能允许杂 合的模块之间进行功能性连接。 a：已经鉴定了不同的 模块内和多肽内的连接 件，并由此指导合成模 块之间的聚酮体中间体 ，这里需要合适的氨基 和羧基末端连接配对， 以产生功能性连接模块 ； b：在构建功能性互补 体时，可以使用编码来 源于不同微生物多个模 块的全亚基； 如图所示：来源于苦霉 素（picromycin）的 PKS（PikAI和PikAII） ，与来源于竹桃霉素（ oleandomycin）的PKS （OleA3）相结合。 4）通过操作脱氧糖途径基因的组合生物合成 n对已经发现的由自然界中植物、真菌和细菌产 生的很多具有生理活性的糖苷类化合物的分析 发现，连接在苷元上的糖基的结构大多为6-脱 氧己糖（6-deoxyhexoses, 6DOHs）。 n据统计，这些具有生理活性的糖苷类化合物的 结构上含有70多种不同的6-脱氧己糖。 6-脱氧己糖的种类类具有生理活性的化合物产产生菌* D-Desosamine红红霉素 竹桃霉素 苦霉素 巨大霉素 Sacc.erythraea S.antibioticus S.Venezuelae M.megalomicea D-Olivose光辉辉霉素 乌乌达霉素 Landomycin S.argillaceus S.fradiae S.cyanogenus D-Oliose光辉辉霉素S.argillaceus D-Mycarose光辉辉霉素S.argillaceus D-Mycaminose泰乐乐星S.fradiae D-Mycinose泰乐乐星S.fradiae D-Mycosamine制霉菌素S.noursei L-Dihydrostreptose链链霉素S.griseus L-Oleandrose竹桃霉素 阿弗米丁 S.antibioticus S.avermitillis L-Mycarose红红霉素 巨大霉素 泰乐乐星 Sacc.erythraea M.megalomicea S.fradiae L-Noviose新生霉素S.spheroides L-Rhodinose乌乌达霉素 Landomycin Granaticin S.fradiae S.cyanogenus S.violaceoruber L-Daunosamine柔红红霉素S.peucetius L-NogaloseNogalamycin S.nogalater L-Megosamine*巨大霉素M.megalomicea L-Rhodosamine阿克拉霉素S.galilaeus L-EpivancosamineChloroeremomycin A.orientalis 2-Deoxy-L-fucose阿克拉霉素S.galilaeus 由放线菌产生的具有不同生理活性 的糖苷化合物的结构特性 n具有单糖残基的化合物：红霉素A、柔红霉素、 urdamycin A和rebeccamycin； n具有双糖残基的化合物：光辉霉素（ mithramycin）； n具有三糖残基的化合物：乌达霉素A（ urdamycin A）和光辉霉素（前者同时具有单糖 和三糖残基，后者同时具有双糖和三糖残基） ； n以O-糖苷键连接的化合物：红霉素A、光辉霉素 、柔红霉素和乌达霉素A； n以C-糖苷键连接的化合物：乌达霉素A； n以N-糖苷键连接的化合物：rebeccamycin。 由放线 菌产生 的具有 不同生 理活性 的糖苷 化合物 的化学 结构 a）通过将竹桃霉素产生菌S.antibioticus中齐墩果糖基转移酶基因在不同的 S.erythraea中的表达，得到了3O鼠李糖基红霉素和6dEB衍生物，以及 一个desosaminylated tylactone； b）改造来源于刺孢霉素（calicheamicin）产生菌的基因，可以得到一个新的脱 氧氨基糖，并将其附着在S.lividans产生的苷元上； c）在S.lividans产生菌中构建desosamine的途径，然后导 入通过遗传操作的DEBS，可以得到具有新颖结构的 desosaminylated大环内酯类文库。 将竹桃霉素产生菌抗生链 霉菌中编码竹桃霉素 oleandrose糖基转移酶的基 因oleGII，（该酶负责将相 应的糖基转移到8，8a-脱 氧竹桃内酯（8，8a- deoxyoleandolide）的4 位羟基上），整合到红霉 素产生菌eryBV缺失突变株 中，eryBV基因编码的糖 基转移酶负责将L- mycarose糖基转移到6-脱 氧红霉内酯（6- deoxyerythronolide）甙元 的相同位置，并进行表达 ，结果得到了将天然糖基L -rhamnose转移到6-脱氧红 霉内酯4位的新红霉素衍 生物，其具有抗菌活性， 将泰乐菌素产生菌弗氏链霉菌中编 码mycaminose糖基转移到泰乐菌 素甙元上的转移酶基因tylM2整合 到红霉素产生菌三缺失突变株 SGT2，（分别缺失聚酮体合成酶 基因、mycarose和desosamine糖基 转移酶基因，但仍然具有合成L- mycarose和D-desosamine的能力） ，并使之表达，同时在培养过程中 外源加入16-元环的泰乐酮（ tylactone），结果得到一种新的泰 乐星衍生物5-O-desosaminyl- tylactone，如图）所示。说明泰乐 菌素产生菌中的转移酶TylM2能够 识别和转移不同的氨基糖。 这两个例子同时也表明抗生素糖基 转移酶具有较宽的底物专一性。 5）通过表达杂合基因方法 的组合生物合成 第一个例子是应用有些大环内酯类抗生素3或 4位的羟基酰化酶基因，使某些大环内酯类 抗生素在相应的位置酰化： 1）异戊酰螺旋霉素（来自碳霉素的4”异戊酰 辅酶A转移酶的carE基因 ）； 2）丙酰螺旋霉素（来自麦迪霉素的4”丙酰化 酶的mpt基因）； 3）乙酰泰乐菌素等（来自碳霉素的3O乙酰转 移酶的acyA基因）。 引入外源酶基因产生杂合抗生素 丙酰螺旋霉素基因工程菌构建图 必特螺旋霉素的结构 R1 H R2 COCH2CH(CH3)2 COCH3 COCH2CH2CH3 COCH2CH3 COCH2CH3 COCH3 2、蒽环类抗生素产生菌 的组合生物合成 蒽环类抗生素是一类临床上非常重要的 抗肿瘤抗生素，它们同样是PKS生物合成 途径，因此，通过以下集中组合生物合 成的方法，可以得到一系列“非天然的 天然杂合化合物”。 1）通过破坏靶基因的组合生物合成 通过基因框内的诱变或缺失，或插入抗 生素耐药基因盒的方法，可以将所选择 的靶基因特异性地钝化； 尽管靶基因的破坏可以得到新的化合物 ，但会出现错误的结果，这是因为一方 面由于极性效应影响下游基因的表达， 另一方面受到由于外源DNA片断的插入造 成的反义RNA合成影响上游基因。 1）通过破坏靶基因的组合生物合成 在光神霉素（mithramycin）产生菌 S.argillaceus中，破坏编码葡萄糖1磷酸 胸苷5三磷酸胸苷转移酶的基因mtmD 后，获得了两个四环类的光神霉素衍生物： premithramycinone和4脱甲基 premithramycinone衍生物； Premithramycinone的抗肿瘤生物活性与光神 霉素相似，且有趣的是其化学结构与来源于黑 曲霉A.niger的神经肽受体抑制剂BMS非常相似 ，如图所示。 通过基因破坏后得到的两个光神霉素 衍生物和BMS-192548 2）通过表达杂合基因方法 的组合生物合成 来源于S.fradiae的urdE基因，编码一种 氧化酶，其可能涉及到将1分子氧引入到 乌达霉素结构中； 在控制启动子ermE的条件下，将其在丁 省霉素C产生菌S.glaucescens中表达， 产生一种新的杂合化合物，6羟基丁省 霉素C，如图所示。 通过将乌达霉素产生菌的urdE基因在丁省霉素C产生菌 中表达，得到一种杂合产物6羟基丁省霉素C 2）通过表达杂合基因方法 的组合生物合成 另外一个实例是，将柔红霉素产生菌 S.peucetius中编码11-aklavinone-羟化 酶的基因（dnrF），在阿克拉霉素产生 菌S.galilaeus中表达，结果得到了一种 新的杂合化合物，11羟基阿克拉霉素A ，如图所示。 这种羟基化的产物，其对白血病细胞和 黑色素瘤细胞的生物活性比阿克拉霉素 要强。 杂合化合物11羟基阿克拉霉素A的组合生物合成 2）通过表达杂合基因方法 的组合生物合成 通过这种组合生物合成的方法，已经获得了 数个杂合糖苷化的丁省霉素，如用含有一个 完整埃罗霉素（elloramycin）基因簇（具 有产生8去甲基丁省霉素C的能力）的黏粒 转化乌达霉素产生菌或光神霉素产生菌，可 以得到四种新的糖苷化合物：齐墩果糖基、 鼠李糖基、mycarosyl丁省霉素C和双齐墩果 糖基丁省霉素C，如图所示。 有趣的是，这些脱氧糖在乌达霉素和光神 霉素苷元上的附着位置，与在埃罗霉素的附 着位置不同。表明，这些聚酮体的糖基转移 酶具有底物宽泛性。 杂合糖苷化丁省霉素的组合生物合成 能够被ElmGT糖基转移酶转移的一些 糖基和elloramycin甙元的结构 表柔红霉素和表阿霉素基因工程菌的构建 表柔红霉素和表阿霉素基因工程菌的构建 通过钝化dnmV基因，得到一个柔红霉素和阿霉 素产生菌的阻断突变株，dnmV基因编码4酮基 还原酶，其与合成这类抗生素结构中的脱氧糖， 柔毛霉胺的合成有关。 分别将阿维菌素产生菌中编码合成齐墩果糖的基 因avrE，以及红霉素产生菌中编码合成mycarose 的基因eryBIV，克隆到dnmV基因阻断突变株中。 由于重组工程菌中的外源基因表达的4-酮基还原 酶的特性与柔红霉素产生菌中的4-酮基还原酶不 同，前者具有非对映立体催化特性而能够形成L- epidaunosamine（表柔毛霉氨）。而突变株dnmV 生物合成甙元的能力和合成糖基转移酶的能力仍 然保持，且由于糖基转移酶的底物专一性较差而 不影响将表柔毛霉氨连接在原来的蒽环酮上，从 而得到4-表柔红霉素和4-表阿霉素，如图所 示。 表柔红霉素和表阿霉素基因工程菌的构建 二、具有非核糖体生物合成肽类途径的 微生物药物产生菌的组合生物合成 n具有非核糖体生物合成途径（none ribosomal peptide synthases，NRPSs ）的环肽或糖肽类“天然产物”，如万 古霉素、博莱霉素、环孢菌素A和埃坡霉 素等进行了大量的研究工作，并取得了 令人注目的成果。 Chloroeremomycin 生物合成 n（1）小分子准备 在酶的催化下生成装配过 程中需要的小分子化合物，对于万古霉素族糖 肽类抗生素而言包括：非蛋白氨基酸和TDP-L- b-epivancosamine； n（2）装配 上步准备好的氨基酸通过腺苷化 反应（adenylation）转换成为腺苷酸，而后 与邻近肽载体蛋白（peptide carrier protein, PCP）上的巯基形成硫酯（ thiolation），PCP之间的缩合功能域（ condensation）催化肽键形成。经过几个延伸 过程，最后TE域将完成的肽切下。有时过程中 还会有差向异构作用(epimerisation)。 n（3）装配后修饰 在这步反应中通常进行氧 化反应和糖基化，对于有的化合物还存在N端 甲基化反应。 万古霉素的生物合成 另据研究，天然的万古霉素生物合成共有 35步，其先以五种自由的氨基酸单体合成 一线形的七肽，然后芳基边链在交联酶的 催化下适时地组合、交联，形成复杂的七 肽骨架，最后UDP-glucose和UDP-4-epi- vancosamine在糖基转移酶的作用下连接 到七肽骨架上。 万古霉素生物合成的五种起始自由氨基酸单体 万古霉素生物合成的逆向合成分析图 在万古霉素家族中发现的糖基 GtfE糖基转移酶识别并将UDP-glucose 转移至七肽骨架上 GtfD糖基 转移酶 识别并 将4epi vancosamine 连接至 万古霉 素骨架上 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状 n糖肽类抗生素的组合生物合成主要有4条途经: n第一，提供新的氨基酸单体，或者是利用已知生物合 成途经中的酶来催化生成新的我们所需要的氨基酸单 体，使合成新的七肽骨架; n第二，改变七肽NRPS装配线上的基因，从而达到重新 设计生物合成途经的目的; n第三，在七肽装配之后，干预修饰酶（tailoring）作 用的步骤，包括N甲基化、酪氨酸的羟化等; n第四，利用糖基转移酶将不同结构的糖基与不同苷元 连接以及连接不同的个数，从而产生具有不同生理活 性的最终产物。因此糖苷化酶可以作为一种制备各种 不同糖苷化合物的催化剂，有可能从中找到具有潜在 应用价值的新活性物质。 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状 nSolenberg等从万古霉素产生菌东方拟无枝酸 菌C329.4中克隆到了两个糖基转移酶基因gtfE 和gtfD，并从chloroeremomycin产生菌中克隆 到了3个糖基转移酶基因gtfA、gtfB和gtfC; n将gtfB和gtfE在大肠埃希氏菌中表达，研究了 其体外活性。结果表明当TDP-葡萄糖存在时， 从大肠埃希氏菌中表达的糖基转移酶GtfB和 GtfE能够在体外将葡萄糖转移到万古霉素糖苷 上，从而得到中间体DVV（desvancosaminyl vancomycin）; n当底物换为UDP葡萄糖，UDP-D-木糖时，仍 然能够转移到万古霉素糖苷上; nGtfE也能够将TDP/UDP-葡萄糖转移到无糖基化 的化合物A47934和A41030上，而GtfB不能将化 合物A47934糖基化，表明GtfE相对于GtfB底物 特异性差。 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状 n在Matsushima等建立地无糖基化合物 A47934产生菌丰加链霉菌（ Streptomyces toyocanesis）基因转移 系统的基础上，Solenberg等还成功地将 含有糖基转移酶基因gtfE的质粒导入到 丰加链霉菌中，得到了糖基化的A47934 衍生物。 GtfE和GtfB在体内进行的糖苷化反应 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状 nLosey等采用化学酶法合成了很多NDP-葡萄糖 的类似物来研究GtfD和GtfE的催化活性。结果 表明，GtfE不但能用UDP-葡萄糖类似物，TDP- 葡萄糖类似物作为糖基供体，同时还可以采用 脱氧葡萄糖类似物以及氨基在2、3、4、或6位 的TDP/UDP-葡萄糖类似物作为糖基供体; n更值得注意的是，一般来讲GtfD将 vancosamine连接至万古霉素的假糖苷的葡萄 糖配基上，试验结果表明GtfD还可以将4-epi- vancosamine连接至GtfE以不同的糖基供体为 底物所催化生成的衍生物上（糖基化位点在2- 脱氧的除外）。这样产生的带有两个氨基糖的 万古霉素衍生物就提供了一种新的结构，以便 于继续进行类似于oritavancin的烷基化从而 提高生物活性。 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状 nChen等从chloroeremomycin 的生物合成基 因簇中克隆到了L-epivancosamine的合成基 因，在大肠埃希氏菌中表达，并成功地在体外 重建了从TDP-4-酮基-6-脱氧D-葡萄糖经过C-2 脱氧合作用(deoxygenation)、C-3胺化 (amination)、甲基化(methylation)、C-4酮基 还原、C-5表构异化等步骤得到了TDP-L