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第六章 酶 第一节 概述 第二节 酶的命名与分类 第三节 酶分子的组成与结构 第四节 酶催化作用的机制 第五节 酶促反应动力学 第六节 酶的分离纯化 第一节 概述 1.概念：酶（Enzyme）：是生物活细 胞产生的，以蛋白质为主要成分的生 物催化剂。 2.生物催化剂 一、酶是生物催化剂 克隆酶、遗传修饰酶蛋 白质工程新酶 生物催化剂 （Biocatalyst） 蛋白质类 (天然酶、生物工程酶) 核酸类 模拟生物催化剂 3.胞外酶与胞内酶 酶虽是由细胞产生的,但并非必须在 细胞内才能起作用,有些酶被分泌到细 胞外才发生作用。这类酶称“胞外酶 ”。大部分酶在细胞内起催化作用称 为“胞内酶”。 什么是催化剂？在化学反应里能改变其他 化学物质的化学反应速率，而本身的质量 和化学性质在反应前后都没有发生变化的 物质叫做催化剂。 酶就是与所有催化剂一样能显著改变化学 反应的反应速率，反应前后不发生任何变 化的物质。 二、酶的催化作用 盐酸 蔗糖 蔗糖 蔗糖酶 蔗糖 真空 无菌 无变化 蔗糖 盐酸 果糖+葡萄糖蔗糖 蔗糖酶37 果糖+葡萄糖 实验： 实验中盐酸和蔗糖酶就是催化剂，它们 都可以显著加快化学反应的反应速率，自 己本身在反应前后不发生任何改变。 催化剂能加快化学反应的原理： 根据有效碰撞理论，分子之间的有效碰撞 是发生化学反应的条件，而只有活化分子 、原子或离子才能发生有效碰撞。因此， 在发生化学反应之前，反应物需要吸收能 量，由普通分子（原子、离子）转变成活 化分子（原子、离子），所需的能量称为 活化能。 活化能： 在一定温 度下， 1mol底物 全部进入 活化状态 所需的自 由能，单 位J/mol。 催化剂可以使反应的活化能大大降低，使 得一些原本需要激烈条件（如高温、高压 等）才能发生的反应在较温和的条件下即 可发生，因此大大加快了反应速率。 蔗糖分解反应的活化能为32万J/mol；加入 盐酸后反应的活化能降为25000J/mol,加入 蔗糖酶后反应的活化能降为9400J/mol。 三、酶的作用特点 （一）与无机催化剂相比，有如下共同点 ： 反应前后都不发生数量和质量变化； 能加快反应速度,但不改变反应的平衡点 ； 从热力学上看,只能催化热力学上允许进 行的反应，都能降低反应所需的活化能 。 （二）酶的作用特点 1.化学本质是蛋白质 2.高度专一性 3.高效率 4.条件温和 5.活性可调控 1.酶是蛋白质 1926年Sumner第一次从刀豆种子中提 取了脲酶结晶，证明其具有蛋白质性质 。30年代，Northrop又分离出结晶的胃 蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶，证 明酶的化学本质是蛋白质。 v酶具有蛋白质的特性如：两性解离 、胶体性质、加热使酶变性、颜色反 应等； v酶可以被蛋白酶水解而丧失活性； v许多酶的氨基酸顺序已被测定； v1969年人工合成了牛胰核糖核酸酶 。 2.高度的专一性 一种酶只能作用于某一类或某种特定 的物质，这种性质称为酶的专一性。 （1） 结构专一性 概念：酶对所催化的分子化学结构的特 殊要求和选择。 类别：绝对专一性和相对专一性 （2） 立体异构专一性 概念：酶除了对底物分子的化学结构有 要求外，对其立体异构也有一定的要求 类别：旋光异构专一性和几何异构专一 性 绝对专一性：有些酶只作用于一种底 物，催化一个反应， 而不作用于任何其 它物质。 如：过氧化氢酶底物：过氧化氢 琥珀酸脱氢酶底物：琥珀酸 相对专一性：这类酶对结构相近 的一类底物都有作用。包括键专一性 和基团专一性。 消化道内几种蛋白酶的专一性 反应速度与不加催化剂相比可提高 1081020，与加普通催化剂相比可提高 1071013. 3、高效率 例 2H2O22H2O+O2 1mole H2O2酶 能催化 5106mole H2O2的分解 1moleFe3+ 只能催化610-4mole H2O2的分解 4、条件温和 酶促反应一般要求在常温、常压、中性 酸碱度等温和的条件下进行。因为酶是蛋 白质，在高温、强酸、强碱等环境中容易 失去活性。而非生物催化剂的作用条件就 比较苛刻了。 例： N2+3H2 2NH3 人工合成：300个大气压，500，铁催化 剂； 生物合成：常温、常压、中性 5、可调控性 与化学催化剂相比，酶催化作用的最显 著的特征是其催化活性可以自动地调控 。生物体内进行的化学反应，虽然种类 繁多，但非常协调有序。底物浓度、产 物浓度以及环境条件的改变，都有可能 影响酶催化活性，从而控制生化反应协 调有序的进行。 一个失去控制的酶已经毫无意义，在生 物体内也不会起作用。 第二节酶的分类与命名 一、酶的分类： 根据酶所催化的反应类型，可将酶分为 六大类：氧化还原酶类，转移酶类，水解 酶类，裂合酶类，异构酶类，合成酶类。 1、氧化还原酶类 凡能催化底物发生氧化还原反应的酶，均 称为氧化还原酶（oxido-reductases）。 此类酶中包括有脱氢酶、加氧酶（ oxygenases）、氧化酶（oxidases）、还 原酶（reductase）、过氧化物酶（ peroxidases）等 其中种数最多的是脱氢酶。脱氢酶催化的反 应，可用通式表示为： AH2 B A BH2 例：乙醇+NAD+ 醇脱氢酶 乙醛+NADH+H+ 由氧化酶所催化的反应可表示为： 2AH2 O2 2A 2 H2O 例：酶褐变（多酚氧化酶，酪氨酸酶） 2.转移酶：催化基团转移反应， 即将一个底物分子的基团或原子转移 到另一个底物的分子上。 例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转 移反应： 3.水解酶：催化催化底物的加水 分解反应。 主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸 酶及脂酶等。 例如，脂肪酶催化的脂的水解反 应： 4.裂合酶：催化从底物上移去某 些基团而形成双键的非水解性反应及 其逆反应的酶。 主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨 酶等。 例如， 延胡索酸水合酶催化的 反应。 5.异构酶：催化同分异构体的相 互转变，即底物分子内基团或原子的 重排过程的酶。 例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化 的反应。 6-磷酸葡萄糖6-磷酸果糖 6.合成酶：又称为连接酶，能够催 化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成 反应。这类反应必须与ATP分解反应 相互偶联。 如：Gln合成酶, 丙酮酸羧化酶,乙酰 辅酶A合成酶。 A + B + ATP AB + ADP + Pi 二、酶的编号： EC、类、亚类、亚亚类、顺序号 类：表示反应性质，前面所述的六大 类； 亚类：表示反应性质：如第一类中的 氧化、脱氢； 亚亚类：表示作用键的类型或受体； 顺序号：表示底物。 如乙醇脱氢酶的标码是EC1.1.1.1，表示它 属于氧化还原酶类、第一亚类、第一亚亚 类、排号第一 国际酶学委员会标志 二、酶的命名 1.习惯命名法 底物名称 脲酶、淀粉酶、蛋白酶 反应性质 脱氢酶、加氧酶、转氨酶 两者结合 琥珀酸脱氢酶、谷丙转氨酶 酶的来源 胃蛋白酶、木瓜蛋白酶 2.国际系统命名法 底物1：底物2 反应类型 如：琥珀酸：FAD氧化还原酶 第三节 酶的组成与结构 一、酶的组成 按化学成分酶分为：单纯酶和结合酶 1.单纯酶：只由蛋白质组成，如脲酶 、淀粉酶、蛋白酶。 2.结合酶：除蛋白质外，还有对热稳 定的非蛋白小分子物质，称辅因子。 辅因子：辅酶、辅基、金属离子 辅酶:与酶蛋白结合疏松， 用透析法可以除去. 辅基:与酶蛋白结合紧密， 不能用透析法除去 小分子有机化合物. 往往是由维生素参与形成的小分子有机物 。如：NAD+,FMN,FAD. 金属离子：与酶蛋白结合，有的紧，有的松 如：Cu2+,Fe3+. 酶蛋白与辅因子单独存在时，均无催化活 力。只有二者结合成完整的分子时，才具有 酶活力。此完整的酶分子称为全酶（ holoenzyme）。 全酶= 酶蛋白 辅因子 主导作用 辅助作用 酶蛋白本身决定酶反应的专一性及高效性， 而辅因子直接作为电子、原子或某些化学基 团的载体起传递作用，参与反应并促进整个 催化过程。 通常一种酶蛋白只能与一种辅酶结合 ，组成一个全酶，作用一种底物，向着 一个方向进行化学反应。而一种辅酶， 则可以与若干种酶蛋白结合，组成为若 干个全酶，催化若干种底物发生同一类 型的化学反应。如乳酸脱氢酶的酶蛋白 ，只能与NAD+结合，组成乳酸脱氢酶 ，使底物乳酸发生脱氢反应。但可以与 NAD+结合的酶蛋白则有很多种，如乳 酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶及磷酸甘油脱 氢酶中都含NAD+，能分别催化乳酸、 苹果酸及磷酸甘油发生脱氢反应。 由此也可看出，酶蛋白决定了反应底 物的种类，即决定该酶的专一性，而辅 酶（基）决定底物的反应类型。 二、酶的结构 （一）酶的结构与蛋白质的结构相同 ，是具有一定空间结构的蛋白质。 （二）根据酶蛋白的结构特点，酶可 分为： 1.单体酶: 只有一条多肽链,分子量 在13,000-35,000之间，一般是水解 酶, 如蛋白酶、羧肽酶。 2.寡聚酶：由两个或两个以上的亚基 组成,亚基之间由非共价键相连，亚 基可以是相同的,也可以是不同的， 分子量在35,000-几百万，如丙酮酸 激酶、乳酸脱氢酶。 3.多酶复合体：由几个酶有组织的聚 集在一起,功能上相互配合，第一个酶 的产物是第二个酶的底物，如丙酮酸 脱氢酶、脂肪酸合成酶。 三、酶的活性中心 （一）活性中心的概念 酶的活性中心：指酶分子中直接和底物结 合，并和酶催化作用直接有关的部位。 (二）、催化部位和结合部位 从功能上看，可以认为活性中心有两个功能部 位，一是与底物结合的结合部位，决定酶对底 物的专一性；二是催化底物发生键的断裂及新 键形成的催化部位，决定酶促反应的类型，即 酶的催化性质。 （三）必需基团:参与构成酶的活性中心 和维持酶的特定构象所必需的基团，包 括活性中心基团及维持活性中心的基团 。 活性中心 结合部位 催化部位 与底物结合，决 定酶的专一性 底物的敏感键在此处断裂而形成新键 ，决定酶的高效性 酶分子 必需基团 其它部分（非必需基团） 活性中心 维持活性中心的必需基团 结合部位 催化部位 调控部位 酶分子中存在着一些可以 与其他分子发生某种程度 的结合的部位，从而引起 酶分子空间构象的变化， 对酶起激活或抑制作用 （四）酶活性中心的形成 酶蛋白多肽链经过盘绕折叠形成特定 的空间结构，使相关的AA形成微区。 Asp His Ser 活性中心重要基团: His57 , Asp102 , Ser195 胰凝乳蛋白酶的活性中心 为Tyr 248 为Arg 145 为Glu 270 为底物 羧 肽 酶 活 性 中 心 示意图 一些酶活性中心的氨基酸残基 酶氨基酸残基数 活性中心残基 牛胰核糖核酸酶A124His12 His119 Lys41 溶菌酶129Asp52 Glu35 木瓜蛋白酶212Cys25 His159 枯草杆菌蛋白酶275His64 Ser221 胰凝乳蛋白酶245His57 Asp102Ser195 碳酸酐酶His93ZnHis95 His117 （五）酶活性中心的结构特征 1.活性中心是酶分子表面的一个凹穴， 一定的大小和特殊的构象，在与底物 接触时表现一定的柔性。 X-Y 2.构成活性中心的大多数AA残基为疏 水性的，使此小区形成一个非极性的 微环境，有利于与底物作用。在活性 中心内仅有少数极性AA残基以其功能 基团直接与底物作用。 活性中心的AA在一级结构上相距很远 ，甚至不在一条肽链上，但在三级结 构上比较靠近。 胰凝乳蛋白酶的活性中心 3.在活性中心，底物以弱键与酶结 合（有利于产物形成）。 （六）酶原 1.酶原：某些酶在细胞内合成或初分 泌时没有催化活性，这种无活性状态 的酶前身物称为酶原。 2.酶原激活：酶原变成酶的过程（切 去几个AA的肽段）。 实质：酶活性中心的形成或暴露过程。 1、胃蛋白酶原（pepsinogen）的激活 2、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活 第四节 酶的作用机制 一.酶催化作用的本质：降低反应活化能。 E+S P+ E ES 能 量 水 平 反应过程 G E1 E2 S 二、中间产物学说酶降低活化能 的原因 酶（E）与底物（S）结合生成不稳定的 中间物（ES），再分解成产物（P）并释 放出酶，使反应沿一个低活化能的途径进 行，降低反应所需活化能，所以能加快反 应速度。 许多实验事实证明了ES复合物的存 在。ES复合物形成的速率与酶和底 物的性质有关。 三、酶专一性的作用机理（理论） 1.锁钥学说 认为底物分子或底物分子的一部分象 钥匙那样，专一地楔入到酶的活性中心部 位，也就是说底物分子进行化学反应的部 位与酶分子活性中心具有紧密互补的关系 。 酶专一性的“锁钥学说” 锁钥学说无法解释酶活性中心有一定柔性 2.诱导契合学说 该学说认为酶表面并没有一种与 底物互补的固定形状，而只是由于底 物的诱导才形成了互补形状。 酶专一性的“诱导契合学说” 第五节 酶促反应动力学 一、酶促反应速度（V）：单位时间 内产物的生成量或单位时间内底物 的消耗量。 在反应初期，产物 增加得比较快，酶 促反应的速度（ dP/dt） 近似为一个常数。 随着时间延长，酶 促反应的速度便逐 渐减弱（即曲线斜 率下降） 酶反应过程曲线 二、酶活力的测定 （一）酶活力的概念及表示方法 1.概念： 检测酶含量及存在，很难直接用 酶的“量”（质量、体积、浓度）来 表示，而常用酶催化某一特定反应的 能力来表示酶量，即用酶的活力表示 。 酶催化一定化学反应的能力称酶活 力，酶活力通常以最适条件下酶所催 化的化学反应的速度来表示。 2.酶活力的表示方法 活力单位：规定条件（最适条件）下 ，一定时间内催化完成一定化学反应量所 需的酶量。 国际单位（U）:指在标准条件下，1分 钟内催化1微摩尔(umol)底物的酶量，或是 转化1微摩尔(umol)底物中的有关基团的酶 量。 Katal：指在最适条件下，每秒钟催化 1mol底物转化所需的酶量。简称Kat。 1Kat = 6107 U 注意： p以上的酶单位定义中，如果底物（ S）有一个以上可被作用的化学键， 则一个酶单位表示1分钟使1mol有 关基团转化的酶量。如果是两个相同 的分子参加反应，则每分钟催化 2mol底物转化的酶量称为一个酶单 位。 p在“U”和“kat”酶活力单位的定 义和应用中，酶催化底物的分子量必 须是已知的，否则将无法计算。 （二）酶活力的测定 终点法: 酶反应进行到一定时间后终止 其反应，再用化学或物理方法测定产 物或反应物量的变化。 动力学法:连续测定反应过程中产物底物 或辅酶的变化量，直接测定出酶反应的初 速度。 要求 测定初速度 最适条件 S E 三、底物浓度对酶反应速度的影响 （一）底物浓度对酶反应速度的影响 pH、T、E固定时，V对S作下图： 1.基础 中间产物学说 2.前提 （1）S与E形成中间产物，且整个反应速 度取决于ES P + E （2）产物浓度为0（初速度） （3）S E （4）反应达到平衡 （二）米氏方程（Michaelis-Menten equation） S Et- ES ES ES生成速度： ES分解速度： 当酶反应体系处于平衡时： 即 ： 令 ： 则 ： 经整理得： （1） 米氏方程推导 由于酶促反应速度由ES决定，即： 所以（2） 将（2）代入（1）得 ： （3） 当Et ES时， 所以（4） 将（ 4 ）代入（3），则： 米氏方 程 由米氏方程可以看出： （1）S很小时，SKm，则V=Vmax/Km，一 级反应； （2）S很大时，S Km，则V=Vmax，零级 反应； （3）S处于Km附近时，混和级反应。 （三）米氏常数Km 1.意义： （1） Km：当酶反应速度达到最大反应速 度的一半时的底物浓度，单位mol/L。 即： Km= S （2）Km是酶的特征常数之一。只与酶的 性质有关,而与酶浓度无关。 （3）如果一种酶有几种底物,就有几 种Km值，Km值最小的底物称该酶的最 适底物。Km值还受pH及温度影响。因 此Km值作为常数是在一定条件下而言 的。 （4）当K2K3时，1/Km可以近似地表 示酶对底物亲和力的大小，1/Km愈大， Km愈小，达到最大反应速度一半时所需 浓度就愈小，亲和力就越大。反之亦然 ： Km愈大，亲和力就越小 2.Km值的求法双倒数作图法 测定一个酶促反应的Km的方法 很多,一般最常用双倒数作图法: 改写成直线方程： 斜率=Km/Vmax 1/Vmax -1/Km 实验时，选择不同的S测定相应的V，求 出两者的倒数，1/V对1/S 作图，绘出直线 ，其斜率为Km/Vmax。将直线延长与横轴 相交，在横轴上的截距为1/Km，这样， Km就可以从直线的截距上计算出来。直线 在纵轴上的截距为1/Vmax。 Km值与米氏方程的实际用途： a 由所要求的反应速度（应达 到Vmax的百分数），求出应当加入 底物的合理浓度。 b 由已知的底物浓度，求出该 条件下的反应速度。 eg1.若要求反应速度到达Vmax的99%，其 底物浓度应为： 99%=100%S/（Km+S） S=99Km eg2.若要求反应速度达到Vmax的90%，其 底物浓度应为： 90%=100%S/（Km+S） S=90Km 练习题：已知某酶的Km值为0.05mol.L-1 ，要使此酶所催化的反应速度达到最大 反应速度的80时底物的浓度应为多少 ？ 四、酶浓度对酶反应速度的影响 E v 酶浓度与反应速率成正比 由米氏方程可推导 出酶反应速度与酶 浓度成正比的关系 ： V = VmaxS Km+S = k2ES Km+S = k2S Km+S E 五、pH对酶促反应的影响 1. pH对酶促反应的影响实验结果： pH 最适 pH v 2、最适pH 一般48 动物酶5.56.5；植物酶6.58.0； 酶的最适pH受酶纯度、底物的种类、缓 冲液等影响。 3、酶有最适pH的原因： PH影响酶分子活性中心基团的解离状态； 底物的解离状态；从而影响ES的形成。只 有一种解离状态适合底物与酶的结合。 六、温度对酶促反应的影响 v 温度 最适温度 1.温度对酶促反应的影响实验结果 （1）在温度低时，温度升高， 反应速度 加快。 (2) 温度达到一定时，反应速度达到最大 。 （3）温度继续升高，反应速度不仅不增 加，反而降低 2、最适温度 在一定条件下，酶催化反应速率最大 时的温度为最适温度。 一般动物酶的最适温度为：3545， 一般植物的酶最适温度稍高，通常4055 。 最适温度是酶的特性之一，但是不是固定不 变的常数，其他条件会影响它。与酶作用 时间的长短有关，酶可以在短时间内耐受 较高的温度，然而当酶反应时间较长时， 最适温度就要低一点。 3、温度对酶促反应的影响原理 温度对酶促反应速度的影响，表现为双 重作用：（1）与非酶的化学反应相同， 当温度升高，活化分子数增多，酶促反 应速度加快； （2）由于酶是蛋白质，随着温度升高而 使酶逐步变性，即通过酶活力的减少而 降低酶的反应速度。 4、稳定温度 在一定温度范围内，酶不发生或很少发 生变性失活，这个温度为酶的稳定温度。 大多数酶在温度升高到5060以上活 性就迅速丧失。酶的失活温度与酶的变性 温度很相近。酶的稳定温度与作用时间有 关：作用时间短，稳定温度可以高一点， 作用时间长，稳定温度就低。 有些酶的稳定温度可以在加入保护剂后 而提高。如：淀粉酶稳定温度为 93，加入CaCl2后稳定温度可以提高 到97 。 七、激活剂对酶反应速度的影响 凡能提高酶活性的物质,都称为激活剂 ,其中大部分是离子或简单有机化合物。 按其分子大小可分为： 1、无机离子 （1） 金属离子：K+ 、Na+ 、Mg2+、Zn2+、 Fe3+、Cu2+ 等； （2）阳离子, -淀粉酶受Cl-激活； （3）H+，胃蛋白酶受H+激活； 2.有机分子 （1）某些还原剂GSH、半胱氨酸等； （2）EDTA、金属螯合剂，能除去酶中的 重金属杂质，解除抑制。 3.具有蛋白质性质的大分子物质 酶原 酶 蛋白酶 八、抑制剂对酶促反应的影响 有些物质能与酶分子上某些必须基团 结合（作用),使酶的活性中心的化学性质 发生改变，导致酶活力下降或丧失，这种 现象称为酶的抑制作用。 能够引起酶的抑制作用的化合物则称 为抑制剂（inhibit