原核生物的转录及调控.ppt

原核生物的转录 及其调控 RNA transcription and regulation in prokaryotes 转录：在DNA指导的RNA聚合酶催化下，以DNA链 的一条链为模板，按照碱基配对原则合成RNA链 的过程。 不对称转录：在DNA双链分子中，转录通常只在 DNA的一条链上进行，另一条链则不能转录，但 可能对转录起调节作用，这种转录方式称不对 称转录。 转录单位：就是从启动子到终止子的一段DNA序 列。 第一节 转录概述 一、基因的编码链和有意义链 模板链：用于转录RNA的链称为模板链，或负 （）链，又称无义链。 编码链：与模板链互补的DNA链称为编码链， 或正（）链，又称有义链。 二、转录的基本要点 底物：NTP； 模板：反义链； 方向：53 ； 酶：RNA pol ； 产物：RNA单链 转录和复制：都是遗传信息的传递 三、转录起始位点 转录起点位点核苷酸为1。 上游序列upstream ：转录起点的前面的序列， 用负数码（）表示，起点前一个核苷酸为1。 下游序列downstream： 转录起点的后面的序列 ，用正数码（）表示。 没有编号为的碱基。 第二节 原核生物转录的相关酶类 一、E.coli RNA聚合酶 E.coli只有一种聚合酶； E.coli RNA pol全酶由5种亚基组成，即 2，480kD； 2 构成核心酶，核心酶与因子构成 全酶。 E.coli RNA聚合酶的基本性质 RNA polymerase in prok. Core EnzymeHolo Enzyme for elongation for initiation 依靠静电作用力依靠空间结构 非专一性与非特异DNA 结合专一性与 特异DNA结合 半衰期；60 半衰期；数小时 cover 60bp Richard Burgess and Andrew Travers (1969) 150 kD 160 kD 70 kD 40 kD Cartoon illustrating separation of the subunits of E. coli RNA polymerase by SDS-PAGE 1、核心酶：催化磷酸二酯键的形成 亚基：2个，功能多样（核心酶的组建因子、 促进双链的解开和重新聚合、启动子识别、促 进RNA pol与DNA 模板链上游转录因子结合） 亚基：1个，结合核苷酸底物，催化磷酸二酯 键的形成； 亚基：碱性强，与模板链结合； 二、RNA聚合酶各亚基的功能 2、因子： Reusable； 修饰 RNA pol 的构型； 识别启动子，但无催化活性。 不同原核生物具有基本相同的核心酶，但亚基 有所差别，决定了原核生物基因的选择性表达。 3、原核生物RNA聚合酶抑制剂： 利福平（Rifampin）：与细菌RNA pol 亚基结合，阻碍转录的起始作用； 利链菌素（ streptolydigin）：与细菌 RNA pol 亚基结合，抑制转录的延伸。 肝素：与细菌RNA pol 亚基结合，阻 碍其与模板DNA的结合。 第三节 原核生物转录的过程 RNA的转录包括promotion，elongation，termination 三过程； 从promoter到terminator称为transcriptional unit； 原核生物中的转录单位多为 polycistron ； 转录起始点记为+1，其上游记为负值，下游记为正值 。 +1 -10 +10 upstreamstart pointdownstream 一、转录的起始 关键：全酶能以很高的亲和性结合在启 动子promoter ； 启动子：RNA聚合酶识别、结合并起始 转录的一段DNA序列。 promoter 由两个重要部分组成 （一）原核启动子的结构 -70 -40 ：up element（上游元件） CAP-cAMP binding site -35 -10：core promoter（核心启动子） RNA pol. binding site 基因表达调控的正控制位点 CAP ： Catabolite gene Activator Protein cAMP Acceptor Protein （cAMP受体蛋白） （分解代谢基因激活蛋白 ） 1、核心启动子： Sextama Box： （R site） TTGAC（Sextama Box） -35 site。RNA pol. loosely binding site Pribnow Box： TATAAT（pribnow Box ） -10 site。RNA pol. firmly binding site（B site ） Initiation site ： +1 site。 RNA transcriptional startpoint （I site） A/G -35 (R)-10 (B)+1 (I) RNA l Sextama Box与Pribnow Box间距17bp，有利于RNA pol启动 l -35 Box or -10 Box mut. 间距趋近于17 bp，up mutation 间距远离于17 bp，down mutation 17bp的间距比17bp的序列对转录更为重要 -35 Box and -10 Box mut. 转录效率下降100倍 转录效率下降1000倍 2、上游元件： CAP-cAMP binding site （Activator region，AR） 当：ARI + CAP-cAMP AR I ： CAP-cAMP 的强结合位点（-70 -50） AR II： CAP-cAMP 的弱结合位点（-50 -40） cooperative effect 提高ARII 的结合效率 IR -70 ARI -40 ARII IR -50 RNA pol AR II + CAP-cAMP 复合体： 促使-35 box附近GC岛区的双螺旋结构稳定性降低，-10 box的解链温度降低，有利于转录启动 ARI ARII GC Island -35 -10 Null AR II RNA pol. into -10 Box but transcription off ARII + CAP-cAMPpromotion RNA pol. into -35 Box into -10 Box starting transcription RNA pol RNA pol -CTD CAP-cAMP ARI ARII ARI ARII Activation transcription Up element + CAP-cAMP RNA Polymerase复合体 CAP-cAMP 与RNA Polymerase的-CTD结合，激活转录 （二）原核基因转录的起始 1、因子的作用： 降低全酶与一般DNA的非专一性结合力（ 20000倍）； 增强全酶与启动子R site、B site的专一性结 合力 （100倍）； 导致RNA链的延伸缓慢 Promoter与 factor 间的结合专效性 决定了 strong promoter & weak promoter； -35 box, -10 box的差异影响启动子与RNA pol 中因子的结合能力； 不同启动子的-35，-10 box间存在较为保守的标 准序列（标准启动子）； factor is responsible for recognition of consensus sequence of promoter and only required for initiation. 2、RNA pol与启动子的结合 因子识别启动子上结合位点。 RNA pol全酶 与-35 box结合封闭型启动复合物； 酶向-10 box移动，并与之牢固结合，促使-10 box及起始位点处发生局部解链开放型启动 复合物； DNA解螺旋扩展到-10 box下游17bp范围。 3、转录起始位点的决定 酶与-10 box 的结合，决定了第一个起始碱基 的选择。 第一个被转录的碱基离-10 box 的保守T约 69nts。 mRNA的起始位点多为G，其次为A ，很少 为U, 起始点核苷酸的两侧分别为C 和T。 4、三元复合物的形成和因子的解离 RNA合成一开始，就形成模板-RNA pol- RNA的三元复合物。 因子解离，核心酶与模板的亲和性下降到 非特异性结合的水平，RNA pol在DNA链上 变得容易移动，为链的延伸创造了条件； 游离的因子可以重新进行功能循环。 转录的起始 核心酶在因子帮助下特异性结合到DNA上； RNA pol与启动子-35 box 结合，形成封闭型起始 复合物； 酶滑动到-10 box，转变成为开放型起始复合物， 启动子活化，双链解开，模板链暴露，插入最初 的2个核苷酸； 酶继续加上开头的几个NTP，形成三元起始复合 物，在RNA链合成了89个碱基后，因子解离 ，转录开始。 Model of the interaction between E. coil RNA polymerase holoenzyme and a promoterDNA Incorporating the first few Nt 二、原核生物转录的延伸 RNA pol沿着模板链移动，RNA链不断延伸， 并保持三元复合物的结构； 转录泡中的DNA螺旋前开、后合，RNA延长 ，不断脱离DNA； RNA链的延伸速度不是恒定的，在模板富含 GC的区域，转录就会减慢/停顿。 17bp 螺旋解开长度 12bp DNA-RNA复合体长度 影响RNA延伸速度的因素： RNA pol； 暂停信号：导致转录速度突然出现变化的特 殊序列。 GC富集区：产物RNA不易释放； IR：产物形成茎环结构，妨碍上游的模板恢 复双链。 其他配基：ppNpp、NusA蛋白。 NusA protein ： 69 Kd, acid protein RNApol-attaching factor Impel RNApol. pausing in terminator for 1-15 and waiting for Rho factor to stop transcription of RNA After initiation substituting NusA + core E antitermination N protein utilization substance NusA binds to polymerase, and N binds to both NusA and box B of the nut site region of the transcript, creating a loop in the growing RNA. This complex is relatively weak and can cause antitermination only at terminators near the nut site (These conditions exist only in vitro.). (Nut N binding site ) antitermination N protein 三、原核生物转录的终止 转录的终止依赖于RNA产物的特定序列； 原核和某些真核生物的终止子要求转录产 物RNA 3端具有发夹的二级结构，茎部富 有GC序列； 终止子的分类： 根据终止反应是否需要 蛋白 1、不依赖于因子的终止子（强终止子） 结构特点：RNA具有一个发夹结构（富含GC ）和随后polyU片段。 作用机制：RNA pol + 发夹结构 转录暂停 后随杂合分子不稳定的poly(U-dA) RNA 容易从模板上脱落RNA-DNA-RNA pol 解聚 转录终止 2、依赖于因子的终止子（弱终止子） 因子：55kD，六聚体。能够利用水解ATP 释放的能量使RNA从三元复合物中释放出 来； 结构：仍然具有茎环结构，但GC碱基对含 量较少，下游也缺乏polyU结构。 1 、 2 、 3 、 终止类型回文序列后随序列 不依赖因子的终止子富含GC富含U 依赖因子的终止子不富含GC不富含U 第四节 原核生物转录的调控 基因表达的调控主要发生在转录水平； 转录水平上的调控是最为经济、灵活，又是最 为重要、复杂的调控； 确定需要转录基因的起始位点； 精细调节基因表达的水平； cis factor 与 trans factor 严格又灵活的互作； 保证RNA pol的连续转录，准确终止。 一、原核转录调控的相关概念 （一）诱导和阻遏： 诱导：酶的合成取决于特定物质（常为substrate ）的存在。如培养基中乳糖的存在促进了E.coli的 半乳糖苷酶的合成； 阻遏：当培养基中某种物质（常为product）含量 较高，细胞就关闭合成这种物质的能力。如培养 基中Trp的存在抑制了E.coli Trp的合成； （二）调控的效应物 v调节蛋白 + 小分子物质 原核操纵子的诱导/阻 遏。这些小分子是基因表达的调节物质-效应物 。 诱导物（inducer）：与调节蛋白结合，使其从 DNA分子上脱落下来，RNA pol开始转录。 辅阻遏物（co-repressor）：与调节蛋白结合， 可以提高调节蛋白与操纵基因的亲和性，进而关 闭结构基因的转录。 （三）正调控和负调控 正调控：调节蛋白与操纵子结合后促进 转录的进行。 负调控：调节蛋白与操纵子结合后抑制 转录的进行。 正、负调控都存在着诱导和阻遏。 positive active inactive Ind. Rep. 正调控 + 诱导 调节蛋白无活性转录不 进行 诱导物+调节蛋白有活 性调节蛋白转录进行 正调控 + 阻遏 调节蛋白有活性转录进 行 辅阻遏物+调节蛋白无 活性调节蛋白转录不进行 negative active inactive 阻遏蛋白有活性转录 不进行 诱导物 + 阻遏蛋白无 活性阻遏蛋白转录进行 负调控 + 诱导 负调控 + 阻遏 阻遏蛋白无活性转录 进行 辅阻遏物 +阻遏蛋白 有活性调节蛋白转录不 进行 Ind. Rep. Negative 二、操纵子理论（operon concept） 定义：原核生物基因表达和调控的单元。 包括： 结构基因：编码控制某一代谢途径的相关的酶 ； 调控元件：是调节结构基因转录的一段DNA序 列，包括启动子和操纵基因； 调节基因：其产物（调节蛋白）能够识别并结 合操纵基因，决定结构基因的转录与否。 （一）lac操纵子（lactose operon）： 1、lac操纵子的结构 调节基因（I）：编码阻遏物（Repressor）。 启动子（Promoter，P）：RNA pol的结合位点； 操纵基因（Operator，O）：进入结构基因的开关 ； 结构基因：Z（-半乳糖苷酶）、Y（-半乳糖苷透 过酶）、A（-半乳糖苷乙酰基转移酶） ； -半乳糖苷酶：水解含-半乳糖苷键的底物， 如乳糖。 -半乳糖苷透过酶：使外界的-半乳糖苷能透 过E.coli细胞壁和原生质膜进入细胞内。 -半乳糖苷乙酰基转移酶：乙酰CoA+-半乳糖 苷乙酰半乳糖。 当E.coli需要利用培养基里的乳糖时，前2种酶 是必需的，而最后1种酶则是非必需的。 没有乳糖lacI编码的阻遏蛋白具有活性牢固结 合到操纵基因O上结合在启动区的RNA pol不能通 过Z、Y、A不能转录（和表达） 2、lac操纵子的负向调控机制 负调控 + 诱导 加入乳糖乳糖（诱导物）与阻遏蛋白结合阻遏蛋 白构象变化 阻遏蛋白从操纵基因上脱落 RNA pol 开始Z、Y、A基因的转录表达乳糖被利用 3、 lac操纵子CAP的转录激活作用 正调控 CAP：二聚体，可同时与DNA、cAMP结合； G存在细胞内cAMPCAP二聚体不能单 独与DNA结合lac 操纵子关闭 G缺乏细胞内cAMP CAP与cAMP结合 CAP-cAMP复合物 + lac 操纵子启动子上游 DNA链发生90o弯曲 增强RNA pol与启动 子的结合 lac 操纵子打开 Z、Y、A基因转 录、表达 CAP v乳糖操纵子的协同调节(coordinate regulation) 负向调节与正性向调节协同合作 *阻遏蛋白封闭转录时，CAP不发挥作用 *如没有CAP加强转录，即使阻遏蛋白从lacO上s 释放仍无转录活性 结论：lac操纵子强的诱导作用既需要乳糖又需 缺乏葡萄糖 （二）trp操纵子 Trp的合成：一系列酶促反应的结果（分支酸 邻氨基苯甲酸 吲哚甘油磷酸 Trp）； 1、trp操纵子的