《DNA的复制和修复》PPT课件.ppt

第30章 DNA的复制和修复 本章主要内容 一、DNA的复制 DNA聚合酶 复制的过程 复制的特征 二、聚合酶链式反应 （PCR） 三、DNA的损伤修复 DNA聚合反应的特点： 需要模板指导 以四种dNTP为底物 需要有引物，3-羟基存在 DNA链的生长方向是5 3 产物DNA的序列与模板互补 DNA聚合酶（DNA polymerase ） 温故: 体 内 终止阶段（Termination ） 延伸阶段（ Elongation） 起始阶段（Initiation） DNA复制的过程 SSB 温故: 体 内 DNA复制的特征 半保留复制 （semiconservative replication） 半不连续复制 （semidiscontinuous replication） 温故: 体 内 背景介绍： 获得大量的DNA 化学合成 基因重组 体 外 1983年，美国Cetus公司的Kary Mullis 发明了聚合酶链式反应（PCR）。 二、聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction,PCR) （一） 定义 （二） 发明 （三） 基本原理 （四） 特点 （五） 发展和应用 知新： 体 外 P 674 （一）PCR的定义 聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR)： 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法， 故又称为基因的体外扩增法。 体 外 （二） PCR的发明 故事发生在故事发生在19831983年年4 4月月 7272 94945555 PCRPCR循环循环 在试管中模拟细胞内DNA的复制 DNA聚合酶 美国黄石国家公园的温泉 嗜热水生菌 Taq DNA聚合酶 耐高温DNA聚合酶 The Nobel Prize in Chemistry 1993 “for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry“ Kary B. Mullis (1944-) La Jolla, CA, USA Michael Smith (1932-) University of British Columbia Vancouver, Canada （三）PCR的基本原理 首先使DNA变性,两条链解开, 然后使引物与模板退火,二者碱基配对; DNA聚合酶随即以4种dNTP为底物,在引物 的引导下合成与摸板互补的新链。 重复这个过程， DNA以指数方式扩增。 体 外 三个阶段 高温（9095 ） 变性 (Denaturation) 循环（n次） 低温（4060 ） 退火(复性) (Annealing) 适温（7075 ） 延伸 (Elongation) 动画 n次循环后DNA序列扩增的数量 No. of No. Amplicon Cycles Copies of DNA 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 25 33,554,432 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon 8 cycle = 256 Amplicon 扩增的公式：Y=( 1+X ) n 其中：Y产量；X扩增效率； n循环次数； 设X=60%， n=30， Y =1.33106 （四）PCR的特点 特异性强 灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低 发展： PCR仪的变迁、PCR的种类 应用： 生物学、医学 （五）PCR的发展和应用 PCR仪 定性 定量 第一代：手动/机械手式+水浴/电加热 PCR仪(热循环仪) +电泳仪+紫外分析仪+定性试剂 第二代：自动化控制型 第三代：终点定量 PCR仪(热循环仪) +荧光仪+终点荧光定量试剂 第四代：实时定量 实时定量PCR仪实时荧光定量试剂 PCRPCR仪的变迁仪的变迁 不对称PCR（Asymmertric PCR） 嵌套式PCR（Nested PCR） 原位PCR（In situ PCR） 逆转录PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR） 实时荧光定量PCR (Real time fluorescent quantitative PCR，FQ PCR) 反向PCR（Inverse PCR） 重组PCR（Recombinant PCR） 多重等位基因PCR（Multiplex allele PCR） Anchored PCR; Long fragment PCR; DDRT-PCR; LM-PCR; RACE; Flow chip PCR; Immuno PCR; LP-PCR; NASBA; RFLP-PCR; AFLP-PCR; RAPD-PCR; SSCP; TAS PCRPCR的种类的种类 PCRPCR的应用的应用 生物学 基因克隆、人工基因构建、DNA序列测定、 基因定点突变、基因型（突变）检测、 SNP分析、遗传背景分析、生物物种鉴定、系统进化研究、 基因表达量研究（Real-time PCR） 、 基因表达谱研究（ DNA chip, SAGE） 医学 临床医学：遗传病诊断、疾病基因检测（肿瘤诊断）、 病原体检 测 法医学： 个体识别、性别鉴定、亲子鉴定 限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性PCRPCR法：法： 限制性内切酶限制性内切酶 恶性肿瘤恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）（癌基因或抑癌基因）检测检测 RasRas基因基因 突变突变 正常人患者 ExampleExample 电电 泳泳 甲型H1N1流感病毒 原理：实时荧光定量逆转录PCR技术 逆转录：RNA cDNA 耗时：两个半小时 病原体检测 ExampleExample 现 嫌1 嫌2 嫌3 在法医鉴定中的应用在法医鉴定中的应用 : : 个体识别个体识别 ExampleExample DNA复制 PCR 与生物体的关系 体内体外 模板自身提取的DNA 引物 RNA引物人工合成DNA引物 反应条件常温 高温变性 低温退火 适温延伸 酶 DNA聚合酶TaqDNA聚合酶 产物双链、全长单链或双链、特定序列 调控信息调控环境 试比较DNA复制与PCR之间的差异 思考题： 三、 DNA的损伤修复 （一） DNA的损伤 化学损伤（脱氨剂、烷化剂） 物理损伤（紫外线的作用） 结果：碱基改变或丢失、骨架中的磷酸二酯 键的断裂、螺旋链形成交联等。 （二） 修复系统的种类 错配修复（ mismatch repair） 直接修复（ direct repair） 切除修复 碱基切除修复（ base-excision repair） 核苷酸切除修复（ nucleotide-excision repair） 重组修复（recommbination repair ） 易错修复（error-prone repair） 2.1 错配修复 （ mismatch repair） 修复在复制中的碱基错配 只能校正新合成的DNA 新合成的链中GATC中的A：未被甲基化 。 错配碱基与GATC之间间隔的DNA序列被 核酸外切酶切除。 E. coli 的 Mut L、 MutS、 和MutH蛋白识别错配碱基 对，并在GATC 序列处产生 1个缺口，包括1kb的片段 MutS MutL MutH A proposed model for methyl-directed mismatch repair in E. coli cells. 2.2 直接修复（direct repair） 胸腺嘧啶二聚体 胸腺嘧啶二聚体 光复活修复（Photoreactivation repair） ： 光复活酶催化的修复，也称为直接修复（ Direct repair）。由可见光激活光复活酶 ，分解因紫外线照射而形成的嘧啶二聚体 ，使损伤部位得以修复的机制。这种修复 分布很广，但不存在于高等哺乳动物中。 修 复 光复活酶 可见光(300-400nm)激活 分解胸腺嘧啶二聚体 光复活修复（photoreactivation repair） 53 5 3 损伤： 形成嘧啶二聚体 光复合酶结合于损伤部位 h 酶被可见光所激活 修复后释放酶 2.3 切除修复 （ excision repair） 2.2.1 碱基切除修复（ base-excision repair ） 单个碱基缺陷：脱氨 胞嘧啶尿嘧啶 腺嘌呤次黄嘌呤 鸟嘌呤黄嘌呤 AP位点：无嘌呤 （apurinic） 无嘧啶 （apyrimidinic） 糖基化酶：切除错误碱基 AP核酸内切酶：切去脱氧核糖-5-磷酸 DNA聚合酶：填补 连接酶：连接 复制前修复 修 复 AP位点 2.2.2 核苷酸切除修复 （ nucleotide-excision repair） 一段DNA损伤：造成DNA螺旋结构较大的变形 修复： ABC切除核酸酶：从两侧切除损伤部位 DNA聚合酶：填补 连接酶：连接 复制前修复 ABC excinuclease Uvr D helicase 2.4 重组修复 （recommbination repair ） DNA发动复制时尚未修复的损伤部位： 可以先复制再修复 缺口 修复： 从同源DNA的母链上将相应核苷酸序列片段移 至子链缺口处，然后用再合成的序列来补上母 链的空缺。 复制后修复 2.5 易错修复 (error-prone repair) DNA链损伤严重 应急反应（SOS ）求得生存 （三）修复系统中的遗传缺陷病 DNA修复缺陷引起的疾病： 着色性干皮病 (Xeroderma pigmentosum, XP) 遗传性视网膜母细胞（retinoblastoma ） Fanconi贫血病（恶性肿瘤） 着色性干皮病（XP）：一种罕见的常染色体隐 性遗传疾病，人缺乏修复系统对日光和紫外光 敏感，易患一种皮肤癌，称为着色性干皮病。 XP患者对日光特别敏感，日光照射后，发生 明显皮肤色斑、水肿，继之出现溃疡，甚至发 生皮肤癌，有的并有神经症状。 名词解释 复制（replication） 半保留复制（semiconservative replication ） 半不连续复制（semidiscontinuous replication） 先导链（1eading