血清谷丙转氨酶alt的测定.ppt

血清谷丙转氨酶活性的 测定（改良赖氏法） n【目的要求】 n1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理 。 n2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作 方法。 n3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义 。 n【实验原理】 n血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37、 pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中 的丙氨酸与-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸 ： 生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加 成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中 生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围 内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系 。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通 过标准曲线查出血清中ALT的活性。 尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝 醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm 的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用 标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光 度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他 比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续 监测法的单位使用赖氏法。1981年全国常规生化检验方法 学术讨论会认为赖氏法测定ALT活性较为合理，全国肝炎 协作会议也建议统一使用改良赖氏法。 n取干净试管12支，按下表所示标号，要求各S管和U管进行双管平行操 作。先做对照管和测定管，在30min保温期间再做空白管和标准管。 n【实验结果】 n1.赖氏法测定ALT的标准曲线(即计量反应曲线) 在 坐标纸上以上表中AnA 0之值为纵坐标，相应的 酶活性的卡门氏单位为横坐标作图，即得赖氏法 测定ALT的标准曲线 n2.标本中ALT活性结果 n查标准曲线 利用测定所得的吸光度结果(AU AB)，便可从标准曲线上查得标本的ALT结果 n计算 将实验测得的AUAB 、AS 代入下面计 算公式，即可算得标本中ALT活性 n n【方法评价 】 nALT活性测定主要有两类。一是卡门氏（Karman ）分光光度法，测定的是酶促反应速率。其原理 如下： n由于NADH在波长340nm处有特异吸收峰，因此 ALT的活性可通过NADH的减少量，亦即通过 340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。这一 方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测 酶ALT的底物外，还需要加入指示酶LDH及其辅 酶NADH，又需用紫外分光光度计，因此不易为 一般临床化验室推广。 二是比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖 氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全 相同。不同之处在于作用时间：King法60min ，Mohun法和 Reiman法 30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是 ：每1ml血清在37条件下与底物作用60 min，生成1mol丙酮酸称为一个 单位。 Mohun 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37条件下与底物 作用30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位 定义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1个卡门氏单 位的定义是：在温度25，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml 血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物 质的量浓度，而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位 的定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关 系：1卡门氏单位=0.4821 IU/L(25)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位 。 n改原赖氏法的反应温度(40改为37)和底物浓度(改为低 浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色 法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较 为一致，能较好反映酶的真实活性。 n由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度 只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只 及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后， 新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控 制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性 较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。 n【临床意义】 n肝细胞中含ALT最丰富，因此当肝脏疾病致肝细 胞受损伤时，ALT即大量释放入血液，致使血清 中ALT活性增高。测定ALT是检查肝功能的重要 指标之一。ALT显著增高见于各种急性肝炎及药 物中毒性肝细胞坏死，中等程度增高见于肝癌、 肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞，轻度增高则