酶工程（中国药科大学）.ppt

第三章 酶工程 授课人：谭树华 博士 联系方式： 1 1 第三章 酶工程 第一节 概 述 一、酶的定义和特性 酶（Enzyme）是生物体内所产生的具有特 殊催化功能的一类蛋白质，也称为生物催化剂 ，生物体内一切化学反应几乎都是在酶的催化 下完成的。 与一般化学催化剂相比，酶具有以下特性 ：1、酶是蛋白质；2、酶的催化效率非常高（ 比一般催化剂高出107-1013倍） ；3、酶具有 高度的专一性；4、酶的反应条件温和（常温 、常压） ；5、酶的催化活性受到调节和控制 。 2 然而，在酶转化反应中，天然酶存在着 以下缺点：1、稳定性差，对热、强酸、强 碱、有机溶剂及重金属离子等十分敏感；2 、天然酶使用后通常不易回收，不能连续使 用，使用效率低，产品成本高，产品质量受 影响。 因此，尽管目前已发现了3000多种酶， 但真正在工业生产上能够得到实际应用的还 只有100种左右。 3 二、酶工程简介 酶工程（Enzyme engineering）是飞速发展 的现代生物技术中四大工程之一。它是指通过化 学方法、酶学方法和DNA重组技术改善自然酶的组 成、结构和性质，以提高酶的催化效率、降低成 本并在大规模工业化生产中进行应用的技术。 4 三、酶工程研究范围 酶工程的研究范围主要包括： （1）酶的研制与生产 （2）酶（细胞）的固定化技术 （3）酶反应器的设计与应用技术 （4）酶分子结构改造和修饰技术 （5）酶的分子定向进化技术 （6）抗体酶技术 5 四、酶工程技术的发展 早期酶工程技术主要是指从动、植物，微生物 材料中提取、分离纯化制造各种酶制剂，并将其应 用于化工、食品和医药工业等领域。 然而，工业上直接利用酶制剂存在一些缺点， 如稳定性差、使用效率低、不能在有机溶剂中反应 等。为了克服这些缺点，延长酶的使用寿命，提高 酶的催化活性，并使其能在生化反应器中反复连续 使用，人们发展了固定化酶技术。 6 1969年日本的千佃一郎等首先在工业生产上应用 固定化氨基酰化酶生产L-氨基酸，至今已有多种固定 化酶（细胞）获得工业规模的应用。例如，固定化葡 萄糖异构酶生产高果糖浆，固定化青霉素酰化酶生产 6-氨基青霉烷酸，固定化微生物细胞生产L-天冬氨酸 和L-苹果酸等。 1971年，第一届国际酶工程学会议在美国新罕布 夏州的亨尼克召开，会议提出的酶工程研究内容为 酶制剂的研制；固定化酶（细胞）及其反应器的研 究与应用。 7 进入20世纪80年代，由于分子生物学、基因工 程技术及细胞工程技术的发展与渗透，酶工程的发 展又产生了一次新的飞跃，并成为现代生物技术的 重要组成部分。 这主要体现在：1、应用基因工程技术大量生产 所需要的酶制剂；2、利用蛋白质工程技术或化学修 饰技术对酶的结构进行改造，从而改善其生化特性 （如提高酶的稳定性与催化活性、消除或降低酶的 抗原性等），使其更适合于生产实际应用。 8 第二节 固定化生物催化剂 固定化技术是现代酶工程技术的重要内容，它 是克服一些天然酶在工业应用方面的不足之处而又 发挥酶反应特点的突破性技术。可以说，没有固定 化技术的开发，就没有现代酶工程。 一、固定化酶及其特征 固定化酶（Immobilized enzyme）指通过物理 和化学的方法将酶束缚在一定空间内且仍具有催化 活性的酶制剂。它是近代酶工程技术的主要研究领 域。广义的固定化酶包括固定化酶和固定化细胞两 类。 9 与天然酶相比，固定化酶具有以下优点： （1）稳定性较天然酶高，如固定化氨基酰化 酶用于拆分DL-氨基酸时，反应半衰期为65天 ； （2）反应后，酶与底物易于分开，并可长期 反复使用，因此，固定化酶又称为“常效酶” 和“长寿酶”，如利用固定化黄色短杆菌的延 胡索酸酶生产L-苹果酸，可以连续反应一年； （3）反应液中无残留酶，产物易于纯化，产 品质量高； 10 （4）可实现转化反应连续化和自动化控制； （5）酶的利用效率高，产品成本低。如每公 斤葡萄糖异构酶干粉固定化后可生产2.1吨果 葡糖，较相同数量天然酶高20倍； （6）转化反应基本无三废排出，因此称之为 “无公害酶” 11 二、固定化细胞及其特征 固定化细胞（Immobilized cell）是指 被限制或定位于特定空间位置的细胞，与固 定化酶一起统称为固定化生物催化剂。 固定化细胞技术是固定化酶技术的延伸 ，因此，固定化细胞技术又称为第二代固定 化酶。其应用较固定化酶更为普遍。 12 固定化细胞的优点在于： （1）无需进行酶的分离纯化、减少起始投资； （2）细胞保持原初生命活动状态，固定化过程 酶回收率高； （3）细胞内酶较固定化酶稳定性更高； （4）细胞内辅因子可以自动再生； （5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应 ； （6）抗污染能力强。 13 由于固定化细胞除了具有固定化酶特点外 ，还具有其自身特点，故其应用更为普遍，它 对传统发酵工艺技术的改造具有极重要的影响 。 目前，工业上已应用的固定化细胞有多种 ，如固定化E.coli生产L-Asp、6-APA、固定化 黄色短杆菌生产L-苹果酸、固定化假单胞菌生 产L-Ala等。 14 三、固定化载体或基质需符合的条件 酶的本质是蛋白质。酶和细胞的固定化 实际上是具有催化活性的的蛋白质的固定化 。酶的催化活性主要依赖于它的特殊的高级 结构活性中心。当高级结构或活性中心 发生变化时，酶的催化活性便下降，酶的的 特异性也可能发生改变，因此在制备固定化 酶时必须严格操作条件，尽可能避免酶的的 高级结构受到破坏。 15 固定化过程中选用的载体或基质需符合 如下条件： （1）固定化过程不引起酶变性； （2）对酸碱度有一定耐受性； （3）有一定机械强度； （4）有一定亲水性及良好稳定性； （5）有一定疏松网状结构，颗粒均匀； （6）共价结合时具有可活化基团； （7）有耐受酶及微生物能力； （8）廉价易得。 16 17 固定化酶 方法 吸附法 共价 结合法 交联法包埋法 凝胶包埋微囊包埋物理吸附离子吸附 四、固定化酶的制备方法 18 19 20 1. 吸附法 吸附法分为：物理吸附法及离子交换剂吸 附法。 用于物理吸附法的载体有高岭土、磷酸钙 凝胶、多孔玻璃、氧化铝、硅胶、羟基磷灰石 、纤维素、胶原、淀粉等。 用于离子吸附法的载体有CM-纤维素、DEAE- 纤维素和DEAESephadex、合成的大孔阳离子 和阴离子交换树脂等。 21 吸附法的优点：操作简单，可选用带不同 电荷和不同形状的载体，固定化过程可以与纯 化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生。 吸附法的缺点：最适吸附酶量无规律遵循 ，对不同载体和不同酶的吸附条件不同，吸附 量与酶活力不一定呈平行关系。此外，酶与载 体之间结合力不强，酶易于脱落，导致酶活力 下降并污染产物。 22 2. 共价结合法 酶分子的活性基团与载体表面活泼基团 之间经化学反应形成共价键的连接法称为共 价结合法。 它是研究最广泛而内容最丰富的固定化 方法。酶分子上含有多种化学基团，但目前 考虑进行共价结合的基团主要是氨基、羧基 、酚基及咪唑基等。 共价结合法有数十种，如重氮化、迭氮 化、酸酐活化法、异硫氰酸酯法、双功能试 剂反应法等。 23 共价结合法的优点：酶与载体结合牢固 ，操作稳定性良好。 共价结合法的缺点：载体需活化，固定 化操作复杂，反应条件较剧烈，酶易失活并 产生空间位阻效应。 24 因此，在进行共价结合法操作之前需要充 分了解相应酶的氨基酸组成及其活性中心氨基 酸组成，选择适当的化学试剂及抑制剂，掌握 化学修饰对酶性质的影响以及酶构象等有关信 息，以便严格控制反应条件，提高固定化酶活 力回收率及其相对活力。 25 在共价结合法中，载体活化是个重要问题， 活化过程首先应考虑使载体获得能与酶分子特定 基团产生特异反应的活泼基团，且要求与酶偶联 时反应条件要尽可能温和。 目前用于载体活化的方法有酰基化、芳基化 、烷基化及氨甲酰化等反应。反应机理及具体方 法可参阅有关专著。 26 尽管共价结合法制备固定化酶研究较多， 但因固定化操作繁琐，酶损失大，起始投资大 ，因之，医药及食品工业中应用者甚少。 27 3. 交联法 交联法是采用双功能或多功能试剂使酶分子 内或分子间彼此连接成网络结构而使酶固定化的 技术。 本法又分为（1）交联酶法、（2）酶与辅助 蛋白交联法、（3）吸附交联法、（4）载体交联 法。 常用交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺-2， 2-二磺酸等。以戊二醛为交联剂的酶结合模式 是将戊二醛与酶分子之间通过Shiffs碱方式相 连接。 28 交联酶法：本法基本过程是向酶液中加入多功 能试剂，在一定条件下形成固定化酶的技术。酶晶体 亦可用交联法固定化，且整个结晶都交联并具有活力 。但交联过程酶易失活。 酶-辅助蛋白交联法：本法系指在酶溶液中加入 辅助蛋白的交联过程。辅助蛋白可采用明胶、胶原及 动物血清白蛋白等。此法酶活力回收率及机械强度较 交联酶法为佳。 29 吸附交联法：本法属吸附与交联相结合的技术 ，其过程是先将酶吸附于载体上再与交联剂反应的方 法。此法兼具吸附与交联双重优点，既提高了固定化 酶机械强度，又提高了酶与载体结合能力，酶分布于 载体表面，与底物接触良好。 载体交联法：同一多功能试剂分子的一部分化 学基团与载体偶联而另一部分化学基团与酶分子偶联 的方法称为载体交联法。其过程是多功能试剂（如戊 二醛）先与载体（如氨乙基纤维素）偶联，洗去多余 试剂后再与酶偶联。 30 4. 包埋法 包埋法分为凝胶包埋法及微囊化包埋法两类 。 凝胶包埋法 ：基本构思是使酶定位于凝胶高 聚物网络中的技术，其基本过程是先将凝胶材料 （如卡拉胶、海藻胶、琼脂及明胶等）与水混合 ，加热使溶解，再降温至其凝固点以下，然后加 入预保温的酶液，混合均匀，再冷却凝固成型和 破碎即成固定化酶。 31 用合成和天然高聚物凝胶包埋时，可通过 调节凝胶材料的浓度来改变包埋率及固定化酶 的机械强度，高聚物浓度越大，包埋率越高， 固定化酶机械强度越大。为防止酶或细胞从固 定化酶颗粒中渗漏出，可在包埋后再用交联法 使酶更牢固地保留于网格中。 32 微囊化包理法 ：将酶定位于具有半透性膜 的微小囊内的技术称为微囊化包理法，包有酶的微 囊亦称为人工细胞。人工细胞半透膜厚约20nm，膜 孔径4nm左右，其表面积与体积比很大，包埋酶量 也多。 33 包埋法优点：制备固定化酶的操作条件 温和，不改变酶的结构，操作时保护剂及稳 定剂均不影响酶的包埋率，适用于多种酶、 粗酶制剂、细胞器及细胞的固定化。 包埋法缺点：固定化酶只适用于小分子 底物及小分子产物的转化反应，不适用于催 化大分子底物或产物的反应。由于扩散阻力 将导致酶动力学行为改变而降低活力。 34 五、固定化酶（细胞）实际应用的重要参数 1、酶偶联效率：固定化反应过程中载体结合蛋 白质的能力称为偶联效率。 偶联效率（%）=（加入蛋白量-上清蛋白量）/ 加入蛋白量100%； 偶联效率（%）=（加入总活力-上清总活力）/ 加入总活力100% 35 2、酶活力回收率：固定化反应后，固定化酶所显 示的活力与加入的酶的总活力的比值称为固定化 反应的酶活力回收率。 活力回收率（%）=固定化酶总活力/加入偶联 液总酶活力100% 3、相对活力：已被固定化的酶活力与同样蛋白量 的天然酶活力的比值称为相对活力。 相对活力（%）=固定化酶总活力/（加入酶活 力总活力-上清液中未偶联酶总活力）100% 36 4、操作半衰期：固定化酶活力下降为原初活力一 半时所经历的连续操作时间称为其操作半衰期，其 长短显示出固定化酶操作稳定性的高低。半衰期 t1/2=0.693/KD KD（衰减系数）=（2.303/t）log(ED / E) ED ：起始酶活力； E：时间t后残留酶活力 37 六、固定化酶的性质 固定化酶可能受到扩散限制、空间障碍、为环境 变化及化学修饰等因素的影响，而导致酶性质及酶活 力的变化。 1、酶活力的变化： 酶固定后活力大都下降，专一性 也可能发生变化，其原因可能是：活性中心的氨基 酸残基与载体的结合影响了酶的催化能力；酶的空 间结构发生变化，导致了酶与底物结合能力或催化底 物能力的改变；酶与底物 结合时产生空间位阻（ steric hindrince)效应；包埋法制备的固定化酶活 力下降的原因还有底物和产物扩散阻力增大。 38 要减少固定化过程中酶活力的损失，反应条件要温 和。此外，反应体系中加入抑制剂、底物或产物可 保护酶的活性中心。 2、酶稳定性的提高：大部分酶固定化后其稳定性及 有效寿命提高。（1）操作稳定性：固定化酶操作稳 定性是影响实际应用的关键因素，一般用半衰期表 示；（2）储藏稳定性；（3）热稳定性；（4）对蛋 白酶的稳定性。 3、固定化酶特性发生变化：天然酶固定化后，其许 多特性，如底物专一性、最适pH、最适温度、动力 学常数Km及最大反应速度VM等均可能发生变化。 39 七、固定化细胞的形状与性质 固定化细胞技术是固定化酶技术的延伸，许多方 法都相同，因此许多固定化细胞的形状与固定化酶的 形状相同，如珠状、块状、片状或纤维状等。 固定化细胞的方法主要是包埋法，其次是交联法 或二者相结合的方法。工业上应用最多的是包埋法制 备的各种形状固定化细胞。 细胞固定化后，其中酶的性质、稳定性、最适pH 、最适温度及Km值的变化基本与固定化酶相仿。但固 定化细胞一般是胞内酶，因此，固定化细胞主要用于 催化小分子底物反应，不适用于大分子底物，且应采 用适当措施提高细胞膜通透性，以提高酶活力及转化 效率。 40 八、固定化酶的形状与性质 根据底物及产物性质的的不同以及反应器类 别的不同，固定化酶的形状主要有： 1、颗粒状固定化酶：颗粒状固定化酶包括酶珠 、酶块、酶片以及酶粉等。颗粒状固定化酶比表 面积大，转化效率高，适用于各种类型的反应器 。 2、纤维状固定化酶：某些材料如三醋酸纤维素 等，用适当溶剂溶解后与酶混合，采用喷丝的方 法即可制成酶纤维。纤维状固定化酶比表面积大 ，转化效率高，但只适用于填充床反应器，制备 过程需要一定设备。 41 3、膜状固定化酶（酶膜）：即可将酶通过共价 结合法偶联至滤膜上制备，也可将某些材料如硝 酸纤维素等用戊二醛交联或其他方法处理后制成 膜状。膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电 极 4、管状固定化酶（酶管）：某些管状载体如尼龙 、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺等，经活化后与酶偶 联即得到固定化酶管。 42 如尼龙管用弱酸水解后释放出氨基和羧基 ，用亚硝酸破坏其氨基，在碳二亚胺的存在下 ，酶分子的氨基与载体的羧基缩合生成管状的 固定化酶，也可将酶与经弱酸部分水解的尼龙 管用戊二醛交联来制备酶管。 目前已制备出糖化酶、转化酶和脲酶等酶 管，酶管在化学分析中可用于连续测定。酶管 的机械强度大，切短后可用于填充床反应器， 也可组装成列管式反应器。 43 第三节 固定化酶（细胞）反应器 用于酶催化反应的装置称为酶反应器（Enzyme reactor），它可以用于溶液酶也可用于固定化酶，同 时还适用于固定化细胞。固定化酶和固定化细胞能否应 用到工业生产，在很大程度上还取决于酶反应器的设计 和选用，性能优良的反应器，可大大提高生产效率。 44 一、酶反应器的类型和特点 酶反应器根据进料和出料的方式，可概括为 两种主要类型：1、批量反应器；2、连续流反应 器。 1、批量搅拌罐反应器（Batch-fed stirred-tank reactor BSTR）：结构简单，但效率不高，主要 用于游离酶反应，难实现自动化。一般只用于小 规模试验，工业生产中的固定化酶很少采用这种 反应器。 45 2、连续流反应器又包括： （1）连续流搅拌罐反应器（Continuous stirred -tank reactor CSTR）：在结构上与批量搅拌罐 反应器基本相同，只不过是连续进料、连续出料 。因为它具有搅拌系统，反应器内的各组成成份 能得到充分混合，分布均匀，并与流出液的组成 相一致。其缺点是由于搅拌桨产生的剪切力较大 ，界面引起固定化酶的破坏。 46 （2）连续填充床反应器（continuous packed-bed reactor plug-flow reactor PFR ）：这种反应 器的使用最普遍，迄今已发表的固定化酶反应器的研 究工作主要集中在填充床反应器。固定化酶通常可以 各种形状，如球形，碎片、碟形、薄片，丸粒等填充 于床层内。它所使用的载体有多孔玻璃珠，珠状离子 交换树脂，聚丙烯酰胺凝胶。二乙胺乙基萄聚糖凝胶 ，胶原蛋白薄膜片等。 47 填充床反应器内流体的流动形态接近于平推 流（又称活塞流），所以填充床反应器可近似认 为是一种平推流反应器（plug-flow reactor PFR ）。这种反应器运转时，底物按照一定的方向以 恒定流速通过反应床。根据底物的流动方式，又 有下向流动，上向流动和循环流动之分。工业生 产中，液流方向常用上向方式，这样可以避免下 向流动的液压对恒床的影响，尤其对生产气体的 反应更为重要。 48 （3）流化床反应器（fluidized-bed reactor FBR） ：在流化床反应器内，底物溶液以足够大的流速向上 通过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态，达到 混合目的。流速应能使酶颗粒不下沉，又不致使颗粒 溢出反应床为宜。该反应器混合程度高、传热传质效 果良好，可用于处理黏性强和含有固体颗粒的底物。 （4）循环反应器(recycle reactor,RCR):这种反应 器是让部分反应液流出，和新加入的底物流入液混合 ，再进入反应床进行循环。其特点是可提高液体的流 速和减少底物向固定化酶表面传递的阻力，可达到较 高的转化率。当反应底物是不溶性物质时，可采用循 环反应器。 49 （5）连续流动搅拌罐-超滤膜反应器（combined CSTR/UF reactor）:由连续流动搅拌罐反应器和 超滤装置组合而成的反应器，它是在连续搅拌反 应罐的出口处装有一半性的超滤膜，该膜只允许 产物和未曾反应的底物通过，而分子量相对较大 的酶则被截留，可使酶反复使用。 50 （a)a)间歇式搅拌罐反应器间歇式搅拌罐反应器（Batch-fed stirred-tank reactor, BSTR）：(b(b) )连续流动连续流动 搅拌罐反应器搅拌罐反应器（Continuous stirred-tank reactor CSTR）：(c(c) )连续流动搅拌罐连续流动搅拌罐- -超超 滤膜反应器滤膜反应器（combined CSTR/UF reactor）:(d(d) )填充床反应器填充床反应器（packed-bed reactor plug-flow reactor PFR ）；(e)(e)循环反应器循环反应器(recycle reactor,RCR):(f(f) )流化流化 床反应器床反应器（fluidized-bed reactor FBR）51 二、酶反应器的选择与设计原则 虽然目前有多种不同类型的反应器可供使用，但 并没有一种通用的理想的反应器，在研究和生产中， 必须根据具体的情况来选择合适的反应器。 1、根据固定化酶的形状来选择。一般颗粒状和片 状的固定化酶对连续流搅拌罐反应器(CSTR)和填充床 反应器（FBR）都适用。如果固定化酶容易变形、易粘 连或颗粒细小时，采用FBR较为适宜。 2、根据底物的物理性质来选择。溶解性好的或乳 浊液底物对任何类型反应器都适用，但颗粒状或胶状 底物往往会堵塞填充床，需要采用高流速搅拌的CSTR 。 52 3、根据酶反应动力学特性来选择。填充床反应 器在固定化酶反应器中占主导地位，它适用于产物 对酶具有抑制作用的反应，若底物对酶具有抑制作 用时，CSTR所受的影响要比流化床反应器（FBR）少 些。 4、根据外界环境对酶的稳定性的影响来选择。 5、根据操作要求及反应器费用来选择。 53 三、酶反应器的性能评价 酶反应器的评价应尽可能在模拟原生产条件 下进行，需要测定的主要参数有：空时、转化率 和生产强度。 空时是指底物在反应器中的停留时间，数值 上等于反应器体积与底物体积流速之比，又常称 为稀释率。当底物或产物不稳定或容易产生副产 物时，应使用高活性酶，并尽可能缩短反应物在 反应器内的停留时间。 54 转化率是指每克底物中有多少被转化成产 物。设计时应考虑尽可能利用最少的原料得到 最多的产物。 酶反应器的生产强度以每小时每升反应器 体积所生产的产品克数表示，主要取决于酶的 特性、浓度及反应器特性、操作方法等。使用 高酶浓度及减小停留时间有利于生产强度的提 高，但并不是酶浓度越高越好、停留时间越短 越好，这样会造成经济上的浪费。 55 第四节 固定化实例 一、DEAE-Sephadex A25吸附的氨基酰化酶 米曲（Aspergillus oryzae）3042扩大曲经40-50h 培养后，曲种以6倍重量冷蒸馏水分二次抽提，白细布 过滤，滤液离心取亮黄色上清液，清液中水解乙醛-DL- 丙氨酸活力约为25mol/(h.ml)。将酶液调节至pH7.0- 7.5。再将充分溶胀并经0.05mol/LNaOH及水预先处理和 洗涤的DEAE-Sephadex A25加至酶液中，其比例为每 60ml酶液加1g湿重的DEAE-SephadexA25,混匀后置冷库 中搅拌过夜。次日吸去上层溶液，再用蒸馏水及 0.15mol/L醋酸钠缓冲液洗涤固定化酶，最后用水洗涤 ，4贮存备用。活力回收率50%-60%，其水解乙酰-DL- 丙氨酸活力为600-800mol/L（h.g湿固定化酶）。 56 二、卡拉胶包埋法制备固定化黄色短杆菌（含延胡 索酸酶） 将8kg 黄色短杆菌悬浮于8L 45生理盐水中； 另取1.6kg卡拉胶溶于34L生理盐水中，两者于50 混匀，再加1.9%聚乙烯酰亚胺4L，混匀，分装于搪 瓷盘中使成3-4cm厚度，冷却至1030min,浸泡于 0.3mol/LKCl溶液中4h,切成0.5cm立方小块，于0.3% 猪胆汁酸溶液中（pH7.5,含1mol/L富马酸）18-20h, 即得延胡索酸块，活力回收率70%左右，用于生产L- 苹果酸，于37操作，使用适当情况下，连续转化1 年以上，活力不减失。 57 卡拉胶包埋法固定B.flavum扫描电镜照 片。A：包埋 ；B：连续运转88天后。58 三、青霉素酰化酶的固定化 抗生素青霉素的衍生物的合成均是6-APA作为基本的 原料。而6-APA是通过青霉素G或青霉素V经青霉素酰 化酶的作用，水解除去侧链而得的产物。青霉素酰化 酶则是通过细菌培养后经细胞固定化而得的产品用于 抗生素的生产工艺。具体操作如下： (1) 大肠杆菌培养 斜面培养基为普通肉汁琼脂培养 基，发酵培养基的成份为蛋白胨2%。NaCl 0.5%，苯 乙酸0.2%，自来水配制。用2mol/L NaOH溶液调 pH7.00，在55.16Kpa压力下灭菌30min后备用。在 250ml三角烧瓶中加入发酵培养液30ml，将斜面接种 后培养18-30h的E.coliD816（产青霉素酰化酶），用 15ml无菌水制成菌细胞悬液， 59 取1mol悬浮液接种至装有30ml发酵培养基的三角烧 瓶中，在摇床上28，170r/min振荡培养15h，如此 依次扩培养，直至10002000L规模通气搅拌培养。 培养结束后用高速管式离心机离心收集菌体，备用 。 (2)E.coli湿菌体100kg，置于40反应罐中，在搅 拌下加入50L10%明胶溶液，搅拌均匀后加2%戊二醛 5L，再转移至搪瓷盘中，使之成为35cm厚的液层， 室温放置2h，再转移至4冷库过夜，待形成固体凝 胶块后，通过粉碎和过筛，使其成为直径为2mm左右 的颗粒状固定E.coli细胞，用蒸馏水及 pH7.5,0.3mol/L磷酸缓冲液先后充分洗涤，抽干， 备用。 60 把上述制得的固定化E.coli细胞（产青霉素酰化酶 ）装填于带保温夹套的床式反应器中，就可连续循 环转化PG或PV成6-APA。 61 第五节 酶工程研究新技术 酶工程 新技术 酶 基因工程 酶的 化学修饰 酶 蛋白质工程 （突变酶） 酶分子 定向进化 抗体酶 62 一、酶的基因工程 DNA重组技术对酶工程的渗透，导致了酶工程 产业质的飞跃，一批重要的工业用酶实现了基因 克隆与高效表达，为新酶种的开发和酶产量的提 高，开辟了新的有效途径。 63 （一）、重要工业酶制剂的基因工程 在酶制剂的基因工程研究中，淀粉酶的 研究最活跃，美国、日本、瑞士等国都已成功 地实现了淀粉酶的克隆与表达，菌株产酶能 力提高了3-5倍。美国CPC国际公司的Moffet研 究中心已获得FDA的批准，可用其研制的基因工 程菌生产淀粉酶。这是第一个由FDA批准用基 因工程菌生产的酶制剂。 64 日本科学家将嗜热脂肪芽孢杆菌的中性蛋白酶 基因克隆到一个不产酶的突变株中，将质粒重组 ，再将两个新质粒分别引入嗜热脂肪芽孢杆菌和 枯草杆菌，酶活力分别提高到原菌株的18倍和10 倍。此外，运用基因重组技术提高葡萄糖异构酶 、糖化酶、木糖异构酶、反丁烯二酸还原酶、纤 维素酶等酶活力的研究也取得了较好的结果。 65 （二）、基因工程菌的固定化 Wagner等人（1980）将E.coli ATCC11105的 青霉素酰化酶基因克隆到质粒上，获得高酶活重 组菌5K（PHM12），并将此菌固定化试图用于生产 。这是基因工程与酶工程技术相结合的第一个实 例。Bruce K H等（1985）应用基因重组技术构建 了丝氨酸和色氨酸合成酶工程菌，这种工程菌组 装的生物反应器可以用苷氨酸和甲醛为原料制造 丝氨酸，反应液含丝氨酸超过400g/L，再从丝氨 酸与吲哚转化生成色氨酸，反应液中色氨酸浓度 达到200g/L。 66 二、酶的蛋白质工程（突变酶） 蛋白质工程技术是基因工程技术的延伸与 发展，它是以蛋白质结构规律与生物功能的关 系为基础，通过分子设计、有控制的基因定点 诱变改造，对现有蛋白质进行定向改造，创造 世界上原来没有但功能上更优越的的蛋白质。 67 合成寡核苷酸定点诱变酶 68 目前世界上约有200家生物工程公司从事这项 研究，美国的Genentech和Cetus公司居领先地位。 他们利用定点诱变法使T4溶菌酶第三位异亮氨酸变 成半胱氨酸，因而可和97位的半胱氨酸形成二硫键 。新酶与天然酶催化活性相同，但由于增加了一对 二硫键，使酶在高温下的稳定性大大增加。 69 英国皇家理工学院和剑桥大学分子生物学实验室 将酪氨酰t-RNA合成酶的第51位苏氨酸变成脯氨酸， 结果酶对ATP的亲和力增强，酶活力提高25倍。 德国BM公司应用蛋白质工程技术，对青霉素酰化 酶基因进行定点突变改造，构建了新结构青霉素酰化 酶工程菌，从而大大延长了固定化青霉素酰化酶的使 用半衰期，其固定化酶柱可连续使用700天以上。 70 三、酶的化学修饰 （一）定义 酶的化学修饰可以简单地定义为在分子水 平上对酶进行改造，即在体外将酶的侧链基团 通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生 物相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶 的酶学性质的技术。 71 （二）修饰酶的特性 酶的化学修饰在一定程度上可以大大改善 天然酶的一些不足之处，这主要表现在：1、 热稳定性较天然酶高；2、减少或消除酶的抗 原性；3、延长药用酶的体内半衰期；4、增加 对蛋白水解酶的抵抗力；5、改善药用酶的组 织分布能力。 72 （三）常用修饰剂： 修饰剂一般要求具有较大的相对分子量、良 好的生物相容性和水溶性、分子表面具有较多的 反应活性基团及修饰后酶活的半衰期较长。主要 有以下几类： 糖及糖的衍生物 ：主要有右旋糖酐、右旋糖 酐硫酸酯、糖肽、葡聚糖凝胶、聚乳糖等； 高分子多聚物：主要是聚乙二醇（PEG）、聚 乙烯醇（PVA）、聚（N-乙烯吡咯烷酮）（PVP） 、聚丙烯酸（PAA）等； 73 生物大分子：常用的有肝素、血浆蛋白质、 聚氨基酸类等； 双功能试剂：主要有戊二醛、二异硫氰酸、 二胺类等； 其它：某些固定化酶载体、糖基化试剂、甲 基化试剂、乙基化试剂及某些小分子有机物等 。 74 （四）应用范例 PEG修饰L-门冬酰氨酶。日本和美国利用 聚乙二醇（PEG）修饰治疗白血病的特效药L- 门冬酰氨酶，使抗原性完全消除，使之更适合 用作治疗药物。 75 四、酶的分子定向进化（Directed evolution in vitro） （一）定义 指无需事先了解酶的空间结构和催化机制 ，而是人为地创造特殊的进化条件，模拟自然 进化机制，使基因发生大量变异，并定向筛选 、获得具有某些预期特征的进化酶的技术。从 而在几天或几周内实现自然界需数百万年才能 完成的事情. 76 （二）目的 在于人为地改变天然生物催化剂的某些性 质，增强其在不良环境中的稳定性，创造天然 生物催化剂所不具备的某些优良特性甚至新的 活性，产生新的催化能力，扩大生物催化剂的 应用范围。 77 （三）定向进化的特点 体外定向进化属于非合理设计,定向进化= 随机突变+ 高通量筛选,它适宜于任何蛋白质 分子,大大地拓宽了蛋白质工程学的研究和应 用范围。特别是它能够解决合理设计所不能解 决的问题。 该技术能够提高酶的催化能力、抗热性、 稳定性及发现新功能。酶的体外定向进化拓展 了酶学工程研究的新领域。 78 （四）定向进化的原理 从一个或多个已存在的亲本出发，利用 TaqDNA多聚酶不具有3，5 ，校对功能，并结 合基因工程现有技术，在待进化的酶基因的 PCR扩增反应中，配合适当条件，以很低的比 率向目的基因中随机引入突变，并构建突变库 。并凭借定向选择（筛选）方法，获得具有某 些预期特征的进化酶，从而排除其它方向的突 变体。 79 80 1、易错PCR技术(error-prone PCR) 2、DNA改组(DNA shuflling) 3、随机引发重组(RPR) 4、交错延伸技术(StEP)：是一种简化的DNA shuffling 技术 （五）定向进化的策略 81 目标酶所需功能方法结果实施菌种 卡那霉素核苷基 转移酶 热稳定性定位诱变+选择在60-50酶半衰期 增加200倍 耐热脂肪 芽孢杆菌 枯草杆菌蛋白酶作用于有机溶 剂 易错PCR+选择在60二甲基亚砜主 仆女冠活力增强170 倍 枯草杆菌 -内酰胺酶作用于新底物DNA改组+选择对cefotaxime的抗性 增加32000倍 大肠杆菌 对硝基苯酯酶有机溶剂中的 底物特异性和 活性 易错PCR+重组活力增加60-150倍大肠杆菌 胸苷激酶第五特异性 基 因理疗 交错延伸+选择活力增加43倍大肠杆菌 -半乳糖苷酶底物特异性DNA改组+选择活力增加66倍底物特 异性增加1000倍 大肠杆菌 砷酸脱毒途径砷酸抗性DNA改组+选择抗性增加12倍大肠杆菌 （六）定向进化的应用 82 五、抗体酶、核酶、模拟酶 （一）抗体酶(Abzyme) 1、定义 抗体酶又称催化抗体（catalytic antibody），是指由免疫系统产生的具 有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区 赋予了酶的属性。它是抗体的高度特异 性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物 。 83 2、抗体酶的诞生 1975年Kohler和Milstein发明了具 有划时代意义的单克隆抗体技术。 1986年Schultz和Lerner首次证实了 由过渡态类似物为半抗原，通过杂交 瘤技术能产生具有催化能力的单克隆 抗体抗体酶 84 3、抗体酶的原理 酶与底物形成过渡态理论：酶的催化 在于能结合底物产生过渡态，降低能障（反 应的活化能）。 以过渡态类似物作为半抗原，诱导与其 互补构象的抗体，使其具有催化活性，可观 察到抗体催化相应底物发生化学反应。 85 4、意义 抗体酶的诞生不仅为酶的过 渡态理论提供了有力的实验证据 。而且抗体酶也将得到更广泛的 应用。 86 4、抗体酶的特点： （1）、结构上抗体酶与抗体一样由两条轻链和 两条重链构成； （2）、抗体酶的可变区具有高度特异性和酶的 催化活性； （3）、酶的种类有限，仅几千种，但抗体酶具 有几乎无限的识别能力。 87 5 5、抗体酶的制备、抗体酶的制备 （1 1）诱导法）诱导法 用设计好的半抗原，通过与载体蛋白 （如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后 对动物进行免疫，取免疫动物的脾细胞与 骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞则分泌单克隆 抗体，经筛选和纯化，得抗体酶。 88 89 （2 2）拷贝法）拷贝法 用酶作为抗原免疫动物得到抗酶 的抗体，再将此抗体免疫动物并进行 单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对 抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活 性的抗体酶。 90 91 （3 3）基因工程法）基因工程法 对于已产生的抗体，分析其氨基酸 序列或相应基因的碱基序列，对抗体结 合部位的基因进行定点突变，在抗体结 合部位换上具有催化作用的氨基酸。 92 5 5、抗体酶的应用、抗体酶的应用 （1 1）抗体酶应用于药物合成）抗体酶应用于药物合成 制备底物专一性稍差的抗体酶，制备底物专一性稍差的抗体酶， 使其一酶多用，可以作用于多个化合使其一酶多用，可以作用于多个化合 物的转化。物的转化。 93 （2 2）治疗可卡因成瘾：）治疗可卡因成瘾： 用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单 酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡 因的分解，水解后的可卡因片断失去可卡因 刺激功能。 94 （3 3）抗体酶前体药物疗法）抗体酶前体药物疗法 首先向机体注入抗体酶，使其与肿瘤 组织特异结合， 当抗体酶结合到靶部位后 ，再给予针对抗体酶的抗体，清除循环中 可能存在的游离抗体酶，然后再注入前药 ，使抗体酶在靶部位活化，杀伤肿瘤细胞 。 95 第六节 生物传感器 (Biosensor) 生物传感器 (Biosensor)是由固定化酶（或细 胞、细胞器等）与适当的换能器件构成的分析系统 ，具有选择性高、分析速度快、操作简单、价格低 廉等优点，而且又能进行连续测定、在线分析、甚 至活体分析。 生物传感器中的关键器件是生物敏感膜（分子 识别元件）和换能器（Transducer)。 96 生物敏感膜是生物传感器的关键元件，它是 由对待测物质（底物）具有高选择性分子识别能 力的膜构成的，因此直接决定了传感器的功能和 质量。 换能器能将生化信号定量地转化成电信号。 根据生物敏感膜的不同生物传感器主要分为 ：酶生物传感器；微生物传感器；免疫生 物传感器； 组织生物传感器； 受体生物传 感器；半导体生物传感器。 97 酶传感器是问世最早、成熟度最高的一类生物传 感器。其原理是利用酶的催化作用，在常温常压下将 糖类、醇类、有机酸、氨基酸等生物分子氧化或分解 ，然后通过换能器将反应过程中化学物质的变化转变 为电信号记录下来，进而推导出相应的生物分子浓度 。 98 目前国际上已研制成功的酶传感器有20 余种，其中最为成熟的传感器是葡萄糖氧化 酶传感器。其分子识别元件由酶膜和微孔滤 器（超滤膜）组成。酶膜由固定化葡萄糖氧 化酶组成；超滤膜可以排除存在于滤液中的 大分子（蛋白质等），但允许葡萄糖底物及 分子氧的通过。 99 在酶膜处发生以下反应： 葡萄糖氧化酶 -D-葡萄糖+O2 葡萄糖酸内酯+H2O2 消耗的氧在氧电极上会反映出O2的减少，由此推知 样品中葡萄糖的浓度。 100 101 第七节 酶工程技术的应用 一、酶工程在制药工业中的应用 酶工程在抗生素、氨基酸、有机酸、甾体类药 物及核苷酸等许多制药领域中具有广泛的应用前景 。 1、抗生素工业 -内酰胺类抗生素，是分子中含有-内酰胺环 的一类天然和半合成抗生物的总称。 分子结构中有一个具抗菌活力的-内酰胺环结 构和一个酰基侧链，酰基侧链对抗菌谱范围、抗菌 活力强度、对青霉素酶的稳定性以及血药浓度的半 衰期、酸中稳定性等理化性质有重要作用。102 半合成-内酰胺类抗生素，主要包括青霉素类 和头孢菌素类。 半合成-内酰胺环抗生素，可用化学方法或酶 的方法将天然青霉素和头孢菌素水解来获得母核， 然后连接人工合成的各种酰基侧链。 然而，-内酰胺环非常脆弱，水解过程及母核 与人工侧链的连接过程中，用化学方法均容易使母 核开环。因此，酶法合成半合成青霉优于化学方法 。 103 104 105 半合成新青霉素过程中的酶法合成 天然青霉素G或V用酶法水解得到6APA，再用 酶法使6-APA与经化学方法修饰的各类酰基侧链发 生酰化缩合反应即可形成各种半合成新青霉素。 以青霉素G或V为原料制备6-APA 以青霉素G为原料酶法生产的6-APA占85%，而 用青霉素V的仅有15%。 106 1、青霉素G（PGA）酰化酶； 2、青霉素V（PVA）酰化酶； 3、苄基青霉素酰化酶 107 Asahi 化学工业公司 生产7-ACA生物反应器 108 2、甾体类药物 甾体的微生物转化是生产甾体药物的重要途 径，但转化产物纯度较低，提取工艺复杂，因此 利用固定化细胞的优点进行转化引起注意。制造 氢化可的松（11-羟化酶），脱氢泼尼松（类 固醇-脱氢酶）