实验紫外分光光度法测定蛋白质含量.ppt

分光光度法分光光度法 分光光度法的原理分光光度法的原理 vvLambert-BeerLambert-Beer定律（光吸收定律）定律（光吸收定律） vv溶液的质量浓度（溶液的质量浓度（C C）越大，液层厚度（）越大，液层厚度（L L）越厚，）越厚， 则溶液对光线吸收得越多。则溶液对光线吸收得越多。 当入射波长、液层厚度和溶液温度一定时（即当入射波长、液层厚度和溶液温度一定时（即KK 吸光系数为定值），溶液对光线的吸收与溶液中吸光吸光系数为定值），溶液对光线的吸收与溶液中吸光 物质的浓度成正比。物质的浓度成正比。 所以可通过测量溶液的吸光度来求得被测组分的所以可通过测量溶液的吸光度来求得被测组分的 含量。含量。 入射光 I I0 0 出射光 I It t 反射光 Ir Ia 吸收光 I It t I I 0 0 T T T T （ transmittance transmittance ）称为透光度称为透光度 ，表示透过光的强度是，表示透过光的强度是 入射光强度的百分比。入射光强度的百分比。 A AC C 光密度与浓度成正比光密度与浓度成正比 T T与与C C成反比，浓度愈大，成反比，浓度愈大，T T愈小愈小 A=A= - lg - lg= = KCLKCL T T A A （AbsorbanceAbsorbance）称为称为吸光度，吸光度，指指溶液对光线的吸收程度溶液对光线的吸收程度 又称为光密度（又称为光密度（Optical densityOptical density， OD OD ）。）。 分光光度法的应用 vv用标准管法计算待测液浓度用标准管法计算待测液浓度 在相同条件下测定在相同条件下测定已知浓度（已知浓度（C C S S ）标准液的吸光度（标准液的吸光度（ A AS S ），及未知浓度（），及未知浓度（C C U U ）溶液的吸光度（）溶液的吸光度（A A U U ），根据定律），根据定律 得：得： A A U U =K=K U UC CU UL LU U ； A A S S =K=K S SC CS SL LS S 因为因为KK U U =K=KS S， ， L LU U =L=L S S 所以所以A A S S 与与A A U U 之比值也等于两浓度之比值之比值也等于两浓度之比值 即即 A A U U/ /A AS S =C=C U U /C/C S S ， C C U U= = A AU U A AS S C C S S 分光光度法的应用分光光度法的应用 vv 用标准曲线法求出待测溶液的浓度用标准曲线法求出待测溶液的浓度 先配制一系列已知浓度的测定物溶液，分别测先配制一系列已知浓度的测定物溶液，分别测 得各管的吸光度。以各管吸光度为纵坐标，测定物得各管的吸光度。以各管吸光度为纵坐标，测定物 含量为横坐标；在方格坐标纸上作图即得标准曲线含量为横坐标；在方格坐标纸上作图即得标准曲线 图。图。 吸光度吸光度A A 蛋白质浓度蛋白质浓度C C（g/mlg/ml） 0.20.2 0.40.4 0.60.6 . . . . . . . . 40408080120120160160 分光光度法分光光度法 vv分光光度法分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物 质或测定其含量的一项技术。质或测定其含量的一项技术。 vv特点：分光光度法灵敏度较高、精确度高、操作简特点：分光光度法灵敏度较高、精确度高、操作简 便、快速。便、快速。 vv分光光度法所使用的光谱范围主要是波谱图中分光光度法所使用的光谱范围主要是波谱图中200200 1000nm1000nm为一段波长的光谱。为一段波长的光谱。 紫外光区紫外光区200200400nm400nm 可见光区可见光区400400760nm760nm 红外光区红外光区7607601000nm1000nm 分光光度计的基本结构分光光度计的基本结构 光源 单单色 光器 吸收池 测测光 机构 钨丝钨丝灯 氢氢灯 氘氘灯 棱镜镜 衍射光栅栅 玻璃比色杯 石英比色杯 硒光电电池 光电电管 光电电倍增管 将光能转将光能转 变为电能，光变为电能，光 电流的强弱与电流的强弱与 溶液的吸光量溶液的吸光量 强弱有关。强弱有关。 v开机，预热2030分钟 v转动波长旋钮，调所需波长。 v调零 v测量并读数 v结束/关机 v清洗比色杯，收拾好仪器及配件，盖上防尘 盖，登记仪器使用登记本。 分光光度计使用的注意事项分光光度计使用的注意事项 vv试管架或试剂瓶不得放置于仪器上，以防试剂溅出试管架或试剂瓶不得放置于仪器上，以防试剂溅出 腐蚀机壳。腐蚀机壳。 vv拉杆动作要轻，防溶液溅出，腐蚀机件。拉杆动作要轻，防溶液溅出，腐蚀机件。 vv比色杯应与分光光度计相配对，禁止随意挪用。比色杯应与分光光度计相配对，禁止随意挪用。 vv比色杯应持其侧壁的比色杯应持其侧壁的毛玻璃面毛玻璃面。 vv盛液时不能太满（约达比色杯盛液时不能太满（约达比色杯2/32/3体积），外壁如有体积），外壁如有 液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。 vv测毕，比色液一般应倒回原试管中，直至计算无误测毕，比色液一般应倒回原试管中，直至计算无误 后方可倒掉。后方可倒掉。 原 理 v大多数蛋白质都含有色氨酸(Trp)、酪氨酸 (Tyr)和苯丙氨酸(Phe)。这些氨基酸有苯环 共轭双键，在紫外光区280nm显示最大光 吸收，且吸光度与浓度成正比。 蛋白质定量紫外分光光度法 试剂配制表（ml） 试试管012345 标标准蛋白质质溶液 （1mg/ml） 0.51.52.54.0 1.0（待 ） 蒸馏馏水4.03.52.51.53.0 浓浓度00.1250.3750.6251 A280 蛋白质定量紫外分光光度法 1.标准管