豆制品中乌洛托品（编制说明）.doc

食品安全地方标准 豆制品中乌洛托品的测定 液相色谱-质谱/质谱法和激光拉曼光谱法编制说明一、标准起草的基本情况（包括简要的起草过程、主要起草单位等）(一)任务来源、起草单位、起草人食品安全地方标准 豆制品中乌洛托品的测定 液相色谱-质谱/质谱法和激光拉曼光谱法列入2012年江苏省食品安全地方标准制定计划项目，并与江苏省理化测试中心、欧普图斯（苏州）光学纳米科技有限公司、苏州药品食品监督检验所等相关承担单位签订委托书，委托书项目编号：JSSPDB2012-004。本项目起草负责人为李新丽，主要起草人有马宁，张厚森，刘芳，贾涛，刘春伟，高宏，吴楚，朱成晶，仲雪，赵厚民，封卫娟等。 (二)简要起草过程1、标准任务下达后，2012年9月成立了标准起草工作组；2、查阅资料，采购样品、标准品、色谱柱、试剂耗材等并召开三家承担单位的标准制定沟通会，确定制定方案。3、2012年11月2013年7月进行方法研究，确定出分析方法，并对方法一和方法二进行了检测结果比对。4、2013年8月11月，对方法进行再优化，邀请验证单位对方法进行验证，并征求意见、编制标准草案、编写编制说明。二、标准的主要技术内容及依据（一）第一法 HPLC-MS/MS法1 方法原理乌洛托品可溶于乙腈，不溶于正己烷，试样经乙腈提取后，提取液用正己烷萃取，减少了乙腈提取液中脂溶性的杂质，采用HPLC-MS/MS法测定，梯度洗脱，外标法定量。2 前处理方法在选择提取溶剂时考察了水、甲醇、乙醇、乙腈等溶剂，水的提取液浑浊，很难分离出澄清液，容易发生堵塞；乙醇能和正己烷互溶，影响脂溶性杂质的分离，增加基质效应；甲醇和乙腈的提取效率相近，考虑甲醇的沸点低和毒性较大，故选择乙腈。考察了超声提取和震荡提取法，发现超声提取会使目标物发生分解，回收率降低、且数据不稳定；考察了震荡提取的震荡频率、提取时间和提取次数等因素，用阳性样品实验发现，当震荡频率200-300次/分钟时，提取20分钟一次就能达到最大提取值，加标回收率95%以上、精密度很好。在净化方法的选择上，考察了固相萃取小柱净化和正己烷净化，参照SN/T2226-2008,采用离子交换树脂小柱，但因为豆制品中可溶于乙腈的基质复杂，采用小柱并不能消除基质干扰，且因为每个小柱的填充差异，影响了方法的精密度和准确性，选择正己烷净化不但步骤简单，而且消除基质效应比小柱好，精密度也能满足要求。3 仪器条件乌洛托品在酸性条件下会分解放出甲醛，采用碱性甲酸铵缓冲盐溶液和乙腈作为流动相不仅可以为质谱的电离源提供足够的带电离子而且可以将整个分离过程维持在一个相对稳定的碱性环境中，可以避免乌洛托品在酸性条件下的分解。实验表明，在碱性色谱条件下比酸性条件下的色谱峰响应值高。豆制品特别是腐竹经过了复杂加工后，基质复杂，对乌洛托品检测干扰很大，即使在前处理中用正己烷进行净化，但基质效应仍然较大，而且相同种类不同品牌豆制品的基质效应差别较大，为此考察了不同比例流动相的等度洗脱、梯度洗脱、不同流速的选择等。实验表明当进样量5L、流速0.2 mL/min、梯度洗脱时可以消除所有基质干扰，用乙腈配置标准曲线，基质提取液加标回收率达到95%100%。为了获得最佳的检测灵敏度乌洛托品采用电喷雾正模式电离。4 测定低限本标准第一法的方法测定低限为5g/kg。5 回收率和精密度因为目前还没有豆制品中乌洛托品的标准限量，回收率和精密度在标准曲线的高、中、低浓度进行加标测定。在阴性样品中加入乌洛托品标准物质，添加的标准品使测试溶液浓度分别为1g/L、2g/L、5g/L 、10g/L（相当于样品中目标物含量分别为5g/kg、10g/kg、25g/kg、50g/kg），进行回收率和精密度实验。经试验发现，腐竹是豆制品中基质干扰最严重的样品种类，常常会是不同品牌的基质干扰都不同，实验室选择了3个品牌的腐竹进行方法研究，这三个样品的产地分别是：成都、上海、南京；其他样品选择了“豆粉、豆腐、素鸡、豆腐干”进行方法试验。方法回收率为86.2%102.0%；添加浓度为定量限时的精密度RSD=3.58%4.84%，添加浓度为2倍定量限时的精密度RSD=3.17%3.89%，添加浓度为5倍、10倍定量限时的精密度RSD小于3%。实验结果见表1表4。样品名称测定值(g/L）回收率（%）相对标准偏差RSD（%）123456腐竹10.8760.9040.9340.9440.9640.98287.698.24.30腐竹20.8810.8870.9020.9230.9630.97688，197.64.31腐竹30.8930.9120.9450.9480.9620.98689.398.63.58豆粉0.8760.8840.9060.9340.9560.96287.696.23.98豆腐0.8680.8720.8940.9240.9460.96686.896.64.41素鸡0.8620.8920.9120.9260.9640.98286.298.24.84豆腐干0.9080.9140.9260.9440.9621.01490.8101.44.17表1 精密度和准确度测试数据(添加浓度1g/L) （平行测定次数n=6）表2 精密度和准确度测试数据(添加浓度2g/L) （平行测定次数n=6）样品名称测定值(g/L）回收率（%）相对标准偏差RSD（%）123456腐竹11.821.871.841.931.962.0191.0100.53.51腐竹21.781.881.901.951.951.9889.099.03.77腐竹31.761.811.851.891.931.9588.097.53.89豆粉1.801.861.881.911.941.9790.098.53.20豆腐1.881.871.921.951.982.0494.0102.03.31素鸡1.791.821.861.881.931.9489.597.03.17豆腐干1.731.781.811.841.891.9286.596.03.84表3 精密度和准确度测试数据(添加浓度5g/L) （平行测定次数n=6）样品名称测定值(g/L）回收率（%）相对标准偏差RSD（%）123456腐竹14.814.724.674.884.914.6893.498.22.16腐竹24.734.794.874.934.844.6492.898.62.17腐竹34.584.814.634.724.854.6991.697.02.19豆粉4.824.604.574.704.664.7991.496.42.14豆腐4.554.444.574.724.674.7888.895.62.70.素鸡4.654.564.774.634.744.8291.296.42.08豆腐干4.754.614.514.714.884.5790.297.62.89表4 精密度和准确度测试数据(添加浓度10g/L) （平行测定次数n=6）样品名称测定值(g/L）回收率（%）相对标准偏差RSD（%）123456腐竹19.579.899.779.609.9210.0895.7101.12.01腐竹29.789.969.929.689.8810.0596.8100.51.33腐竹39.449.529.319.849.749.6493.198.42.05豆粉10.109.549.859.679.819.7295.4101.01.95豆腐9.639.669.589.029.459.7190.297.12.68素鸡9.289.639.759.769.479.5492.897.61.91豆腐干9.379.919.699.479.839.5993.799.12.15（二）第二法 激光拉曼光谱法1 原理利用正己烷与乙腈的极性差异，根据相似相溶原理去除乙腈萃取液中的油性物质等杂质，减少对纳米增强试剂的干扰。2 前处理方法由于拉曼光谱检测易受污染干扰，所以在抽样和制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。考虑到快速检测方法对时间的要求，方法制定过程中回避了固相萃取等耗时较长的净化方法，尽量采取溶液萃取方法达到仪器检测要求。考察了乙腈、乙醇、水等溶剂作为提取试剂的效果。由于水的提取液通常较浑浊（含天然色素或其他食品添加剂等），难以分离，因此弃用水作为提取试剂；而乙醇与正己烷互溶，不利于脂溶性物质的去除，最后采用乙腈作为豆制品中乌洛托品的提取试剂。用正己烷反萃取除去脂溶性杂质后，乌洛托品存在于大量的乙腈提取液中。为进一步降低检测限，需要对提取液进行浓缩，所以再用少量饱和氯化钠溶液从乙腈萃取液中萃取出乌洛托品，同时达到二次分离的效果。纳米增强试剂为纳米金属溶胶，可自行制备，建议直接采用市售纳米增强试剂，如OTR202或相当者。纳米增强试剂为纳米体系，受污染后易沉降失效，应妥善保存以保持稳定，沉降后不可使用。3仪器条件此次检测考察了积分时间、平均次数、平滑参数等仪器条件对检测结果的影响。积分时间过短时反应不完全，得到的检测信号较小，不利于降低检测限，而过长的积分时间则导致检测体系沉降，检测信号同样较小，因此采用了10sec作为最佳积分时间；平均次数设置为2时，检测时间较短同时保证了较好的精密度；平滑参数的设置可以较好的平滑图谱，易于数据的分析，过大的平滑参数则会导致数据失真，最后优化设置成1。因激光拉曼光谱仪的种类和型号不同，具体参数可能有所差异。激光拉曼光谱仪要求激光波长为785 nm，功率在0300mW内连续可调，分辨率6cm-1，光谱范围在100 cm-13300 cm-1或250 cm-12400cm-1。适当增加激光功率可得到更大数值的检测信号，但过大的激光功率易导致数据溢出，建议设置为200mW，并且每批次检测前需校正并固定激光功率，保证数据的可比性。对检测结果进行判断之前，都应对拉曼光谱图进行基线调整，即基线调零。对每批次数据进行基线调整所用的条件应完全一致。4测定限本方法标准的检出限为0.5mg/Kg，取4倍检出限确定测定低限为2mg/Kg。5精密度和回收率对超市购买的腐竹、豆皮、百叶、白干进行检测，确认样品为阴性样品后，分别在空白样品中加标2 mg/Kg、5 mg/Kg、20mg/Kg，进行6次平行测定。得到的结果如下。表4腐竹中乌洛托品检测精密度数据平行号腐竹试样2mg/ Kg5mg/ Kg20mg/ Kg测定结果（mg/ Kg）1.975.9620.1820.181.825.1219.9219.921.685.2320.2920.291.675.3720.1420.141.794.6119.9119.911.695.2520.3220.32平均值（mg/ Kg）1.775.2520.13加标回收率83.5%98.5%92.1%119.2%99.5%101.2%标准偏差（mg/ Kg）0.1160.4350.175相对标准偏差6.6%8.3%0.9%表5豆皮中乌洛托品检测精密度数据平行号豆皮试样2mg/ Kg5mg/ Kg20mg/ Kg测定结果（mg/ Kg）2.054.7919.8919.891.855.3719.9719.971.915.2419.9119.912.054.6120.2420.242.115.1520.0420.042.264.7720.1320.13平均值（mg/Kg）2.044.994.99加标回收率92.5%113.0%95.4%104.9%99.4%101.2%标准偏差（mg/Kg）0.1460.3060.135相对标准偏差7.2%6.1%0.7%表6百叶中乌洛托品检测精密度数据平行号百叶试样2mg/ Kg5mg/ Kg20mg/ Kg测定结果（mg/ Kg）2.215.6420.1920.191.724.7720.1020.102.124.6720.1320.132.065.2919.9419.941.875.4219.9819.982.185.1221.0021.00平均值（mg/Kg）2.035.1520.22加标回收率86.0%110.5%93.4%112.9%99.7%105.0%标准偏差（mg/Kg）0.1930.3760.391相对标准偏差9.5%7.3%1.9%表7白干中乌洛托品检测精密度数据平行号白干试样2mg/ Kg5mg/ Kg20mg/ Kg测定结果（mg/ Kg）1.794.3720.1620.161.964.8420.0720.072.243.9819.8219.821.893.9919.9419.941.653.9620.0720.071.924.4419.9519.95平均值（mg/ Kg）1.914.2620.00加标回收率82.5%112.0%79.1%96.9%99.1%100.8%标准偏差（mg/ Kg）0.1970.3550.122相对标准偏差10.3%8.3%0.6%（三） 方法验证和比对第一法和第二法的验证实验共邀请6家单位参加，方法验证的内容包括：检测限、测定下限、精密度及加标回收率。第一法的验证结果为：检出限0.66g/kg1.00g/kg，检测下限2.64g/kg4.00g/kg，精密度（RSD）0.74%5.58%，回收率86.2%102.9%；第二法的验证结果为：检出限0.47 mg/Kg0.49 mg/Kg，检测下限1.9 mg/Kg2.0 mg/Kg，精密度（RSD）4.7%10.1%，回收率85.1%113.4%。结果表明，两个方法都