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基因芯片技术简介,中山大学附属第五医院 药剂科 临床药学室 冷薇 2009年8月20日,简介,随着人类基因组（测序）计划（human genome project）的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展 越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据正以前所未有的速度迅速增长。 建立新型杂交和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要了。,简介,基因芯片（又称dna芯片、生物芯片） 得益于 探针固相原位合成技术与照相平板印刷技术 激光共聚焦显微技术,大量探针分子 （通常每平方厘米点阵密度高于400）,于固定支持物上,检测每个探针分子 的杂交信号强度,与被标记的样品 分子进行杂交,获取样品分子的 数量和序列信息,一次性对样品大量序列进行检测和分析，解决了 传统核酸印迹杂交（southern blotting和northern blotting等）技术操作繁杂、自动化程序低、操做 序列数量少、检测效率低等不足。,基因芯片（gene chip）的原理,基因芯片的测序原理是杂交测序法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列tatgcaatctag，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置 ，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶序列的核酸。,基因芯片又称dna微阵列（dna microarray）,三种主要类型： 1）固定在聚合物基片（尼龙膜、硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cdna片段通过同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测 2）用点样法固定在玻璃板上的dna探针阵列通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测 3）在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列与荧光标记的靶基因杂交进行检测,把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。,基因芯片原型,主要类型,多种方法将寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上 原位合成（in situ synthesis） 合成点样 支持物： 玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等,薄膜型、玻片型,微板型,集成电路型,原位合成法,主要为光引导聚合技术（light-directed synthesis），不仅可用于寡核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。 主要步骤为： 首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来。 每次选取适当的蔽光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其他部位不透光。 每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光）决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。,优点是可以用很少的步骤合成及其大量的探针阵列,原位合成,压电打印法（piezoelectric printing） 美国incyte pharmaceuticals公司 其装置与普通的彩色喷墨打印机相似，采用常规的固相合成方法。 做法： 将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂所替代，支持物经过包被后，通过计算机控制喷墨打印机将特定种类的试剂喷洒到预定的区域上。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相原位合成技术。,尽管如此，通常原位合成方法仍然比较复杂，除了在基因芯片研究方面享有盛誉的affymetrix等公司使用该技术合成探针外，其它中小型公司大多使用合成点样法。,picture from biodot: ,合成点样,在多聚物的设计方面与前者相似，合成工作用传统的dna或多肽固相合成仪以完成。 合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻片上。 支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷。,现已有比较成型的点样装置出售，如美国biodot公司的点膜产品及cartesian technologies公司的pixsys nq/pa系列产品。,微型机械点样法,化学喷射法,基因芯片的相关技术样品的准备,由于灵敏度所限，多数方法需要在标记和分析前对样品进行适当程序的扩增，不过也有不少人试图绕过这一问题 如： mosaic technologies公司引入的固相pcr方法，引物特异性强，无交叉污染并且省去了液相处理的烦琐； lynx therapeutics公司引入的大规模并行固相克隆法（massively parallel solid-phase cloning），可在一个样品中同时对数以万计的dna片段进行克隆，且无需单独处理和分离每个克隆。,显色和分析测定方法,主要为荧光法 重复性好，灵敏度仍较低。 存在的问题是： 只要标记的样品结合到探针阵列上后就会发出阳性信号，这种结合是否为正常配对，或正常配对与错配兼而有之，该方法本身并不能提供足够的信息进行分辨。 目前正在发展的方法： 质谱法、化学发光法、光导纤维法等,荧光检测法,1）用荧光素标记扩增（或其他放大技术）过的靶序列或样品 2）与芯片上的大量探针进行杂交，将未杂交的分子洗去（如果用实时荧光检测可省去此步） 3）用落射荧光显微镜或其他荧光显微装置对片基进行扫描，采集每点荧光强度并对其进行分析比较,生物芯片基本步骤,生物芯片是将生命科学研究中所涉及的不连续的分析过程（如样品制备、化学反应和分析检测），利用微电子、微机械、化学、物理技术、计算机技术在固定芯片表面构建的微流体分析单元和系统，使之连续化、集成化、微型化。 主要包括四个基本要点： 1）芯片方阵的构建 2）样品的制备 3）生物分子反应 4）信号的检测,芯片制备,芯片制备，先将玻璃片或硅片进行表面处理，然后使dna片段或蛋白质分子按顺序排列在片芯上 目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微距阵的方法将寡核苷酸片段或cdna作为探针按顺序排列在载体上。 芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确的将探针放置到芯片上的指定位置。,样品制备,生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或dna、rna，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。,杂交反应,杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。 芯片上的生物分子之间的反应是芯片检测的关键一步。通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子间的错配比率。,信号检测和结果分析,杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，既可以获得有关生物信息。,基因芯片技术发展的最终目标是将从样品制备、杂交反应到信号检测的整个分析过程集成化以获得微型全分析系统（micro total analytical ayatern）或称微缩芯片实验室（laboratory on a chip）。使用微缩芯片实验室，就可以在一个封闭的系统内以很短的时间完成从原始样品到获取所需分析结果的全套操作。,基因芯片的应用,它以其可同时、快速、准确地分析数以千计基因组信息的本领而显示出了巨大的威力。 1）对多种生物包括南芥（arabidopsis thaliana）、酵母（saccharomyces cerevisiae）及人类的基因组表达情况进行了研究，并用该技术（共157,112个探针分子）一次性检测了酵母几种不同株间数千个基因表达谱的差异。 2）用于核酸突变的检测及基因组多态性的分析，例如对人brca i基因外显子11、cftr基因、-地中海贫血、酵母突变菌株间、hiv-1逆转录酶及蛋白酶基因（与sanger测序结果一致性达到98%）等的突变检测，对人类基因组单核苷酸多态性的鉴定、作图和分型，人线粒体16.6kb基因组多态性的研究等。 3）杂交测序：需通过大量重叠序列探针与目的分子的杂交方可推导出目的核酸分子的序列，需要制作大量探针。,实际应用,1）药物筛选和新药开发 由于所有药物（或兽药）都是直接或间接地通过修饰、改变人类（或相关动物）基因的表达及表达产物的功能而生效，而芯片技术具有高通量、大规模、平行性地分析基因表达或蛋白质状况（蛋白质芯片）的能力，在药物筛选方面具有巨大的优势。 2）疾病诊断 应用于产前遗传性疾病检查、对病原微生物感染诊断、对具有高血压、糖尿病等疾病家族史的高危人群普查、接触毒化物质人群恶性肿瘤普查等等 3）环境保护 4）司法 5）现代农业,6）研究领域 1-基因表达检测 人类基因组编码大约10万个不同的基因，仅掌握基因序列信息资料，要理解其基因功能是远远不够的，因此，具有监测大量mrna（信使rna，可简单理解为基因表达的中介物）的实验工具很重要。 2-寻找新基因 如hme基因和黑色素瘤生长刺激因子 3-dna测序 4-核酸突变的检测及基因组多态性的分析,基因芯片的研究方向及当前面临的困难,难以解决的问题： 技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析范围较狭窄等问题 样品制备： 当前多数公司在标记和测定前都要对样品进行一定程度的扩增以便提高检测的灵敏度，但仍有不少人在尝试绕过该问题。 探针的合成与固定： 光导聚合技术：每步产率不高（95%）； 压电打压、微量喷涂：难以形成高密度的探针阵列 目标分子的标记： 一个重要的限速步骤 目标分子与探针的杂交：