几种三聚氰胺快速检测方法比较.doc

几种三聚氰胺快速检测方法比较2007年3月,美国发生多起因食用宠物食品而导致宠物中毒死亡事件。2008年9月,中国发生因食用三鹿婴幼儿奶粉导致婴幼儿产生肾结石病症的严重事件。两起事件的原因都是在食品或饲料中非法添加大剂量三聚氰胺。因此,如何快速准确的分析食品和饲料中的三聚氰胺成为食品企业、食品管理机构和广大消费者密切关注的问题。 为科学合理地筛选快速、简便、准确、经济的三聚氰胺检测方法，中国计量院提出搭建快速检测方法测试平台的建议，并承担了科技部应急支撑项目“三聚氰胺快速检测技术测试平台的建设”。 该平台启动以来，以权威检测技术为支撑，以盲样测试结果为依据，开展技术评价，在国内首创“统一现场测试、统一评价方案、统一判别依据、统一专家评审、统一现场公布测试结果”的三聚氰胺检测方法评价模式。以国际比对互认为基础，建立乳与乳制品中的三聚氰胺气相色谱同位素稀释质谱法和液相色谱同位素稀释质谱法，为评价快速检测方法奠定了重要的技术基础。 为确保三聚氰胺检测结果的有效性，全面提高检测实验室对原料乳及奶粉中三聚氰胺检测能力水平，测试平台先后组织实施了5轮全国三聚氰胺快速检测技术方法的现场统一测试评价活动，共测试评价了56种检测技术或方法，有效推出液相色谱法、拉曼光谱法、胶体金试免疫层析法（胶体金速测卡法）、酶联免疫法(ELISA试剂盒法)4种三聚氰胺快速检测方法。 本文对常用的三种三聚氰胺快速检测方法：液相色谱法、酶联免疫法和胶体金免疫层析法的原理、特点做简单介绍并对其应用进行比较。 1.液相色谱法国家标准GB/T224002008公布了原料乳中三聚氰胺快速检测的高效液相色谱法（HPLC法）,采用乙腈作为原料乳中的蛋白质沉淀剂和三聚氰胺提取剂,0.2um微孔滤膜过滤后供HPLC测定。采用的色谱柱为强阳离子交换色谱柱,流动相为乙腈缓冲液(10mmol/L柠檬酸,10mmol/L辛烷磺酸钠,调节pH至3.0),采用紫外/二极管阵列检测器检测,定量限为0.3mg/kg,定量灵敏度提高,且分析时间较短。HPLC法虽然应用普遍,但存在一定的局限性,样品前处理过程复杂,仪器昂贵,对检测人员的要求高，检测成本高。 1.1原理 用乙腈作为原料乳中的蛋白质沉淀剂和三聚氰胺提取剂，强阳离子交换色谱柱分离，高效液相色谱-紫外检测器/二极管阵列检测器检测，外标法定量。 1.2主要试剂和材料 1.2.1乙腈（CH3CN）：色谱纯。 1.2.2磷酸（H3PO4）。 1.2.3磷酸二氢钾（KH2PO4）。 1.2.4三聚氰胺标准物质（C3H6N6）：纯度大于或等于99%。 1.2.5三聚氰胺标准贮备溶液：1.00103mg/L。 1.3.仪器 1.3.1液相色谱仪：配有紫外检测器/二极管阵列检测器。 1.3.2分析天平：感量0.0001g和0.01g。 1.3.3pH计：测量精度0.02 1.4检验操作：按国标GB/T224002008要求操作。 2.酶联免疫吸附法(ELISA) 酶联免疫法(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)是在免疫荧光和组织化学基础上发展起来的新技术。其主要是利用抗原与抗体的高特异性反应，通过合适的载体，使酶标抗原或抗体与待测样品反应，形成酶标抗原抗体复合物，在相应的酶底物参与下，复合物上的酶催化底物使之水解成有色物质。一定条件下，呈色物质与待测物的含量直接相关，因此可以根据呈色物质颜色的深浅，对待测样品进行定性定量分析。 近几十年,国内外已建立了数十种药物残留的ELISA分析技术,检测水平可达ng甚至pg水平。一些发达国家已经研制成商品化的检测试剂盒用于快速检测。近十多年来我国也研发出多种商品化的检测试剂盒用于快速检测。 酶联免疫吸附法具有特异性高、灵敏度高、稳定性好、操作简单、成本低，并可同时对大批量样品进行快速检测的特点，目前广泛应用于食品中兽药、毒素检测的初筛中。 08年中国出现“三聚氰胺奶粉事件”时，主要使用的进口三聚氰胺速测试剂盒，现在国内也已研发出商品化的三聚氰胺速测试剂盒，试剂盒灵敏度0.01ppm,最低检测限为0.1ppm,已广泛用于快速检测。 2.1原理 采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被三聚氰胺抗原，样本残留的三聚氰胺和微孔条上预包被的抗原竞争抗三聚氰胺抗体，加入TMB底物显色，样本吸光值与其残留物三聚氰胺成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中三聚氰胺的含量。 2.2主要试剂、材料 三聚氰胺ELISA检测试剂盒 2.3仪器 2.3.1兽药残留分析仪或酶标仪 2.3.2分析天平：感量0.01g 2.4检验操作：按三聚氰胺ELISA检测试剂盒说明书要求操作。 3.胶体金免疫层析技术 胶体金免疫层析技术（ColloidalGoldImmunochromatographicAssay，GICA)是以胶体金为标记物的免疫层析技术，免疫层析(Immunochromatography,IC)技术是20世纪80年代发展起来的一种将免疫技术和色谱层析技术相结合的快速免疫分析方法。其原理是以条状纤维层析材料为固相,借助毛细作用使样品溶液在层析条上泳动,同时,使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(如抗体或抗原)发生高特异、高亲和性的免疫反应,层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带),通过酶促显色反应或直接使用可目测的着色标记物(如胶体金),短时间(510min内)便可得到直观的实验结果。 胶体金免疫层析技术不需进行结合标记物与游离标记物的分离,省去了繁琐的加样、洗涤步骤。因而这种分析技术操作简单快速,分析结果清楚,易于判断,且无须仪器。 胶体金免疫层析技术在医学上应用较多,在食品检测领域的应用在近几年才发展起来。国外在此方面起步较早,现在已经有很多成熟的产品问世,国内这几年也发展较快，有多种应用胶体金免疫层析技术的商业化产品面世，三聚氰胺胶体金速测卡就是其中之一。 三聚氰胺胶体金速测卡检测灵敏度高，结果直观，操作方便、快捷，携带、储存方便，成本低，非常适合于基层执法部门对三聚氰胺的快速筛查。 3.1原理 三聚氰胺胶体金速测卡的检测原理是竞争性免疫层析。将着色标记物与待测抗原的特异性抗体(Ab1)相偶联,沉积在结合区。而检测区处固相化的是待测抗原或待测抗原的类似物。若样品中含有待测抗原,则样品中的抗原和带有标记物的Ab1形成Ag-Ab1复合物。随后在通过固相化有待测抗原或其类似物的检测区时,由于竞争抑制,不再发生反应,检测线处不显色;样品继续前移,Ag-Ab1复合物被固相化在质控线处的抗Ab1抗体(Ab2)所结合,形成Ab1-Ag-Ab2复合物,使质控线显色。 3.2主要试剂、材料 三聚氰胺胶体金速测卡 3.3检验操作：按三聚氰胺胶体金速测卡说明书要求操作。 4.三种三聚氰胺快速检测方法的比较方法液相色谱法酶联免疫吸附法胶体金免疫层析法仪器液相色谱仪兽药残留分析仪/酶标仪试剂（盒）色谱纯试剂ELISA检测试剂盒胶体金速测卡定性、定量定性、定量定性、半定量检测灵敏度0.05ppm0.1ppm0.1ppm样品前处理复杂较复杂简单检测操作方法复杂较复杂简单单个样品检测时间30-