重医仪器分析考试资料.doc

临床检验仪器（仅供参考）1、临床检验仪器常用的性能指标（一）灵敏度； （二）误差； （三）噪音；（四）最小检测量；（五）精度；（六）可靠性；（七）重复性；（八）分辨率；（九）测量范围和示值范围；（十）线性范围； （十一）响应时间；（十二）频率响应范围。 2、（一）灵敏度 灵敏度指检验仪器在稳态下输出量变化与输入量变化之比，即检验仪器对单位浓度或质量的被检物质通过检测器时所产生的响应信号值变化大小的反应能力，它反映仪器能够检测的最小被测量。当灵敏度为定值时，检验仪器系统为线性的。 （二）误差 当对某物理量进行检测时，所测得的数值与真值之间的差异称为误差(error)。误差的大小反映了测量值对真值的偏离程度。 误差通常有两种表示方法。一是绝对误差，它只能说明检测结果偏离实际值的情况，但不能反映出检测的准确程度 ；二是相对误差，它是绝对误差与被测量真值之比。相对误差只有大小和符号无量纲，但它能反映检测工作的精细程度。 （四）最小检测量 指检测仪器能确切反映的最小物质含量。仪表的灵敏度越大，在同样的噪音水平时其最小检测量越小。因此同一台仪器对不同物质的最小检测量也不一样。在比较仪器的性能时，必须取相同的样品。（六）可靠性 可靠性指仪器在规定的时期内及在保持其运行指标不超限的情况下执行其功能的能力。是反映仪器是否耐用的一项综合指标。 （七）重复性 重复性指在同一检测方法和检测条件(仪器、设备、检测者、环境条件)下，在一个不长的时间间隔内，连续多次检测同一参数，所得到的数据的分散程度。 重复性反映一台设备固有误差的精密度。对于某一参数的检测结果，若重复性好，则表示该设备精度稳定。（八）分辨率分辨率是仪器设备能感觉、识别或探测的输入量(或能产生、能响应的输出量)的最小值。 分辨率是仪器的一个重要技术指标，它与精确度紧密相关，要提高检验仪器的检测精密度，必须相应地提高其分辨率。（九）测量范围和示值范围测量范围指在允许误差极限内仪器所能测出的被检测值的范围。检测仪器指示的被检测量值为示值；示值范围指在仪器所显示或指示的最小值到最大值的范围。示值范围即仪器量程，量程大则仪器检测性能好。（十）线性范围 线性范围指输入与输出成正比例的范围。在此范围内，灵敏度保持定值。线性范围越宽，则其量程越大，并且能保证一定的测量精度。大部分临床检验仪器所应用的原理都是非线性的，其线性度也是相对的。当所要求的检测精度较低时，在一定的范围内，可将非线性误差较小的近似看作线性的，这会给检测带来极大的方便。 （十一）响应时间 响应时间表示从被检测量发生变化到仪器给出正确示值所经历的时间。一般来说，响应时间越短越好。如果作为自动控制信号源，响应时间这个性能就显得特别重要，因为仪器反映越快，控制才能越及时。 第二章 显微镜技术和显微镜 光学显微镜（Optical microscope）简称光镜或显微镜，是一种将肉眼无法直接看清楚的微小物体进行光学放大像的常用仪器。一、光学显微镜的工作原理显微镜是由两组会聚透镜组成的光学折射成像系统。把焦距较短、靠近观察物、成实像的透镜组称为物镜（object lens），而焦距较长，靠近眼睛、成虚像的透镜组称为目镜（ocular lens）。被观察物体位于物镜的前方，被物镜作第一级放大后成一倒立实像，此实像再被目镜作第二级放大， 得到最大放大效果的倒立的虚像，位于人眼的明视距离处。二、光学显微镜的性能参数（相互间的关系和对具体操作的影响）光学显微镜有放大率、数值孔径、分辨率、视野、景深、镜像亮度、清晰度、工作距离和机械筒长等九个性能参数。放大倍数和分辨率是两个最基本的性能参数，都和NA相关：放大率和NA成正比，分辨率和NA成反比。由于人眼的分辨极限在12的范围，所以一般把显微镜的总放大倍率取在500NA1000NA之间，称为有效放大率。在实际应用中合理地综合考虑各种技术参数的配置是必要的。数值孔径（numerical aperture）又叫镜口率，是物体与物镜间媒质的折射率n与物镜孔径角的一半()正弦值的乘积，通常缩写为NA，即NA=nsin 显微镜的数值孔径与其放大率成正比，与分辨率、景深成反比，它的平方与图像亮度成正比。 分辨率：显微镜的最重要参数，能够区分开两个质点的最小距离。N与成反比，与成正比。光学显微镜的极限分辨率约为0.22m。提高显微镜分辨率的方法：（1）增大物镜的数值孔径 ：在物镜和盖玻片之间充以n 较大的油，如香柏油n =1.52,不仅使n 增大，而且孔径角也增大。（2）用短波长的光照射： 如紫外光显微镜，电子显微镜。景深与焦长：景深（depth of field）又称焦点深度，是指在成一幅清晰像的前提下，像平面不变，景物沿光轴前后移动的距离称“景深”。景物不动，像平面沿光轴前后移动的距离称“焦长”。 工作距离是指从物镜前表面中心到被观察标本间满足工作要求的距离范围，与物镜的数值孔径成反比。一般情况下，物镜的数值孔径赿大，其工作距离赿小。三、像 差 和 色 差（相差分类名称）（一）像差：实际的光学仪器不可能使物点发出而进入系统的所有光线都是沿着高斯光学的理想光路成像，从而导致成像在形状方面的缺陷，称之为像差。 1球差（最常见） 2彗差(broom aberration) 3像散 4场曲 5畸变(distortion) （二）色差：是一种由白光或复色光经透镜成像时，会因各种色光存在着光程差而造成颜色不同、位置不重合、大小不一致的不同成像效果，从而造成像和物的较大失真。色差分为的轴向色差（）和垂轴色差(）四、光学显微镜的基本结构光学系统：目镜、物镜、反光镜、聚光镜机械系统：镜座、镜柱、镜臂、镜筒、调焦装置、载物台（物镜转换器）放大倍数：目镜的放大倍数物镜的放大倍数（一）光学系统 1.1 物镜物镜除满足光学成像质量外，还需满足：同一台显微镜配用的一套物镜必须满足“齐焦”要求。所谓“齐焦”，就是当某一物镜调焦清晰后，变换物镜转换台的其它物镜时，能基本保证调焦适当，成像清晰。凡物镜外壳上刻有盖波片厚度的，需要配用规定厚度的盖玻片。 对物镜的细纹尺寸均采用同一规格，以利互换使用。物镜的技术参数使用特定的字符标示在镜头外壳上。浸式都注明使用的浸液，上面一行用/NA的形式给出物镜的放大倍数和数值孔径NA，下面一行以L/b的形式给出适用的镜筒长及盖玻片厚度b。 例如：物镜外壳有下列标记“油-100/1.25/0.17”，则表明该物镜为油浸式高倍，放大倍数为100，NA为1.25，对透射光及反射光均适用，镜筒长为很大，在用于透射光时的盖玻片厚度为0.17mm。1.2目镜 显微镜的目镜是在窄光束、大视场的条件下工作的，实际上起的是放大镜的作用。要注意目镜应该满足“三面重合”的要求。在目镜的物方焦平面上设有限制物方视场的光阑，物镜所成放大的实像就成在光阑面上，用于观测的目镜上的分划板和目镜指针也安置在该光阑面上，称“三面重合”。2.显微镜的照明系统（知道用在什么显微镜上）用显微镜观测和研究的物体，大多为自身并不发光的标本。为了看清楚标本不仅需要显微镜有足够的放大倍数和分辨率，还需要能使实验标本有充分的反差和均匀的亮度的适宜照明。根据聚光器和光源的使用方式不同可分为:反射照明：低档普通生物显微镜仅使用凹面反射镜反射自然光而不经聚光器直接给标本照明。也有使用聚光器的，同时使用凹面或平面反射镜，但光源是自然光。 临界照明：使用电光源，照明光经聚光器后再照亮标本。由于光源经聚光器透镜所成的像是和标本所在平面近于重合，既影响观察又可能会因像的亮度的不均匀使标本的照明不均匀。尽管它有着这样的缺点，但因有结构简单的优势而用于普通显微镜。 柯拉照明：可以克服临界照明的缺陷，保证标本的均匀照明。这是一种用在透射光与亮视场中的标准照明方式。这种照明方式使物平面界限清晰、照明均匀，效果比较满意。根据照明光透过物体进入物镜形成的反差类型分为: 明视场法 暗视场法 斜照明法照明系统主要部件:（知道主要部件名称）光源：分为自然光源和电光源二大类玻片：上面一片称盖玻片，下面一片为载玻片（二）机械系统机械系统：镜座、镜柱、镜臂、镜筒、调焦装置、载物台（物镜转换器） 。（知道名称）物镜转换器：是机械装置中结构复杂、精度要求最高的核心组件。视场小，要求转换器和物镜定位槽孔对中准确度不低于0.01mm，对显微镜轴和镜筒基准端面的垂直度、在调焦过程中位移的平行度等方面都有严格的要求。保证 “齐焦”。调焦系统： 调焦的目的：为了充分利用放大倍数和保证清晰成像条件。调焦的基本要求：所调节系统沿着光轴方向做稳定的直线运动。调焦可以有二种途径：一是升降镜筒移动物镜，二是升降载物台移动标本。无论哪种方式都包括微动调焦（微调）和粗动调焦(粗调)两套机构。一般操作时，先粗调迅速地得到标本的像后再仔细微调获得满意的物像.荧光显微镜（名解） ：是以紫外线为光源来激发生物标本中的荧光物质，产生能观察到各种颜色荧光的一种光学显微镜。利用它可研究荧光物质在组织和细胞内的分布。显微镜拆装的注意事项：拆装前应该认真阅读说明书，看清装配图，参照以下的原则进行。（1）依照先光学部件后机械部件的顺序进行拆卸。（2）光学部件的拆卸要按自下而上的顺序进行。（3）组装的顺序恰好与拆卸的顺序相反。（4）在拆装过程中必须牢记部件之间的组装关系，避免错漏。（5）在拆装过程中，零部件要拿稳、放置要到位，顺势自然，紧固要适中，不可强装强卸。（6）注意保护光学元件不受损受污，机械配合面避免损伤、污染。第五章 色谱分析技术和色谱分析仪器（每个系统要求、重要物件要求）一、色谱法概述色谱法（chromatography）是一种物理分离技术，实质上是利用混合物中各个组分在互不相溶的两相（固定相和流动相）之间的分配的差异而使混合物得到分离的一种方法，也有人称之为色层法、层析法等。色谱仪（chromatograph）的实质是利用色谱分离技术再加上检测技术，对混合物进行先分离后检测，从而实现对多组分的复杂混合物进行定性、定量分析。色谱分离中的两相是指系统具有一个有大比表面积的固定相（stationary phase）（可以是固体或以某种方式固定了的液体）和一个能携带待分离混合物流过固定相的所谓流动相（mobile phase）（可以是气体或液体）。二、基本原理色谱是利用待分离的样品组分在两相中分配的差异而实现分离的。由此可见，色谱分离的两要素是互不相溶的两相（流动相及固定相）以及样品（混合物）各组分在两相中分配的差异，它是决定色谱最终分离结果好坏的基础。三、色谱法的分类及特点色谱仪的分类：目前比较成熟的主要是气相色谱仪与液相色谱仪（高效液相色谱仪）两大类气相色谱仪具有高分辨率、高速度、高灵敏度及选择性好等优点。但只能用于被气化物质的分离、检测。而常压下可气化或可定量转变为气化的衍生物的物质，其总的比例大约只占几百万种化合物的20左右。大部分物质不能被气化，因而也就不能用气相色谱法。液相色谱的样品无需气化而直接导入色谱柱进行分离、检测，特别适用于气化时易分解物质的分离、分析。约有70左右的有机物能分析。通常认为有机物质分子量400时，用气相色谱仪；在4001000时，最好用高效液相色谱仪；1000时用凝胶色谱(排阻色谱)。色谱仪的特点 ：根据色谱分离的基本原理可以看出：色谱仪的主要特点是可以对混合物进行多组分分析或全分析。仪器结构简单，操作使用方便，具有应用范围广、样品用量少、高选择性、高效能、高速度以及高灵敏度等优点。（1）应用范围广是指色谱仪可用于所有化合物的分离和分析，既能对有机物、无机物、低分子或高分子化合物，又能对有生物活性的生物大分子分离和测定。（2）样品用量少是指色谱仪用极少的样品就能完成一次分离及分析，进而可以实现痕量分析、微量分析。（3）高选择性是指对性质极为相近的物质，如同位素、同分异构体等，通过选取适当的固定相及流动相和分离条件，可实现分离及分析。（4）高效能是指色谱分析能够分析分配系数极为接近的组分，从而可分离并分析极为复杂的混合物。（5）高灵敏度是指色谱仪能分析含量极微的物质，如气相可检出10-11g1013g物质。液相也接近此精度。 （6）色谱仪的分析速度较快，只需几分钟至几十分钟就可完成一个样品的分析工作四、色谱仪的输出信息1.色谱图（chromatogram： 表明已被色谱柱分离的物质流过检测器的含量与时间的关系。2.基线（base line）：它表明纯流动相流过检测器时所产生的响应。3.色谱峰：色谱峰所包围的面积称为峰面积，是色谱定量分析的基础。4.进样峰（injection peak）和空气峰（air peak）5.保留时间：从进样开始到出现色谱峰最大值所需的时间为保留时间。为定性定量分析依据6.死时间和死体积五、色谱技术在临床检验中的应用 气相色谱仪常用于人体微量元素的快速分析，血与尿等体液中的脂肪酸、氨基酸、甘油三酸酯、甾族化合物、糖类、蛋白质、维生素、巴比妥酸等化合物的分析，分析鉴定药物的组成和含量、检测人体的代谢产物，通过气相色谱仪串联质谱，在“兴奋剂”检测中可分析100余种违禁药品等。第二节 气相色谱仪一台典型的气相色谱仪主要由气路系统、进样系统、分离系统(色谱柱)、检测系统、温度控制系统、数据处理、记录系统及电源、电子线路等构成。图 气相色谱仪结构框图一、气路系统 气相色谱仪的气路系统通常由载气源、减压阀、净化器、稳压阀、稳流阀、柱子及全部连接管道构成（了解名称）。气路系统的目的是向色谱柱提供质地洁净、流动平稳的流动相。二、进样系统（主要部件名称） 进样系统由载气预热器、取样器、样品分流器和进样气化装置等组成。进样系统的要求一方面是准确定量，迅速注入。另一方面气态或经气化的样品能在载气中形成一个窄带集中地进入色谱柱，否则测量结果将毫无意义。三、气相色谱柱及温度控制气相色谱柱：柱管形状一般有三种，即U型管、盘形管和螺线管，其中以U型管最常用。柱子的尺寸应对容量（样品量）和分析速度最佳化。为获得最大效率，可用内径较小、长度较长的毛细管柱。当分析的样品量较大且分离不困难时，可用内径较大、长度较短的填充柱。温度控制：气态样品决定了必须进行温度操作。首先，温度对于固定相十分重要。操作时一定要知道所用固定相温度的极限，把全部操作保持在临界温度以下1015进行。这将有助于延长柱子的使用寿命和避免检测器与其他装置受固定相“流失”所造成的污染。其次，在气相色谱仪中，温度不仅对样品在色谱柱上的分离过程有很大影响，对许多检测器（如热导、电子捕获、示差折光等）的检测结果也有很大影响。即温度的测控与色谱仪的正常工作及其测量结果的可靠性有密切的关系。因此必须实行温度控制。温度控制对恒温箱主要要求可概括为：点温度的稳定性，即测量恒温箱内部任意一点的温度，其精度一般应保持在0.10C0.50C；温度场的均匀性，要求恒温箱内部色谱柱的上、下端及沿柱（不单是一根柱）任意横断面平均温度的差值不超过10C；恒温范围可以调节；绝热性能好，从起动到稳定点的时间要短；要有足够的可用恒温空间，供装色谱柱之用。四、程序升温气相色谱法 气相色谱仪的温度操作（或控制）有恒温（或定温）和程序升温两种方式。在样品中各组分的沸点相差较大时，一般在沸点分布范围大于800C1000C时，采用恒温，分离效果往往就不太理想，此时必须使用程序升温。（一）恒温控制系统 是一种闭环负反馈自动控制系统。由恒温控制电路、恒温箱及测温、补偿等环节构成。电路形式多样，但反馈原理类似。属于连续温度控制的方法，控温精度比断续式温度控制高得多，因此色谱仪中大都采用此控温方式。（二）程序升温控制系统 程序升温就是使色谱柱的温度在分离的过程中按照预定的程序逐步增加。其目的是使样品中每个组分都在最佳的温度条件下流出色谱柱，以保持较好的峰形。常用的程序升温方式有两种：线性程序（单阶线性升温）和非线性程序（多阶线性升温）。六、气相色谱仪的操作在气相色谱仪的操作过程中，要特别注意柱参数的合理选择。它对色谱的分离效果会产生很大的影响，可以认为柱参数就是有关色谱操作的所有参数的统称。1.色谱柱和填料（固定相）所有新柱子，使用前必须经老化处理。2.柱长（以1m3m为宜）3.载气流速（影响样品的保留时间和峰高）4.进样器和检测器的温度5.恒温操作（恒温操作的温度一般要求比样品最高沸点低40左右）6.程序操作7.进样8.初步分析（了解）第三节、高效液相色谱仪主要由溶济输送系统、 进样系统、分离系统(色谱柱)、温度控制系统、检测系统和数据处理与记录系统等构成高效液相色谱仪基本结构一、溶剂输送系统（目的+主要部件名称） 又称输液系统，对其主要要求是能有效的容纳所要求的溶剂，并将溶剂输送到系统的各个有关部位。它应具备宽的流速范围和入口压力范围，并能适用于所有的溶剂。这里的溶剂就是高效液相色谱仪的流动相。该系统主要由液源、脱气装置、高压输液泵、流量控制器及梯度洗脱装置等构成。（二）高压输液泵 是高效液相色谱仪最重要的部件之一，它将洗脱液在高压下连续不断地送入分离柱以完成色谱分离过程。其性能对分离及检测均有十分明显的影响。对高压输液泵的要求：（1）能产生较高的压力推动流动相，且压力要平稳，脉动小。（2）能提供无脉动恒定流量。（3）输送流动相的流量能在较大范围内连续调节。（4）更换流动相方便。（5）便于实现程序控制高效液相色谱仪中常用的高压泵大致可分为两类，一类是恒压泵，另一类是恒流泵，如机械往复式柱塞泵。目前最常用的高压泵是机械往复式柱塞泵机械往复式柱塞泵（注意其压力监测保护）：机械往复式柱塞泵的工作过程是抽液和排液交替进行，因此其输出的流量必然有脉动。克服这个问题常采用下述方法。（1）可通过采用多头泵交替工作。（2）设置压力缓冲器。（3）采用更合理的驱动凸轮几何形状设计方案。控制高效液相色谱仪流动相的有常液洗脱（isocratic elution）和梯度洗脱两种方式。影响色谱分离的因素：1.温度：程序升温; 2.流速：程序变流速; 3.固定相：组合柱;4.流动相：梯度洗脱。梯度洗脱（概念）是在色谱的分离过程中，把两种或更多的不同极性互溶洗脱液随时间按某种变化的比例混合，使流入色谱柱的洗脱液组成作连续的改变。其目的是让样品每个组分都在最佳分配系数的条件下分离出来，以获得较好的峰形。 梯度洗脱分为内梯度洗脱（高压）和外梯度洗脱（低压）两类。二、进样系统 为适应高压条件下进样，进样方式又有停流动相和不停流动相进样两种方式。三、分离系统和温度控制系统分离系统包括色谱柱、填料（固定相）。它承担着样品的分离，是色谱仪最重要的部件之一。色谱柱的高效率是现代高效液相色谱仪的一个显著特点。为达到好的分离效果，色谱柱的选择尤为重要。1、色谱柱管的材料有不锈钢、厚壁玻璃和石英。工作压力超过3.92MPa时，必须用不锈钢管柱。柱管的形状有直管柱和螺旋柱。现在基本上都采用直管柱。柱长和内径是由实际需要的分离度、压力降、分析时间以及样品量的大小综合决定的。2、固定相和流动相2.1.液固吸附色谱法 固定相都是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，所用的吸附剂大部分以硅胶为基体。此外也有用氧化铝、分子筛等的。从结构上看，吸附剂可以分为全多孔型及表面多孔型（或称薄壳型）两类。实际都是一些颗粒。柱管的填充主要根据固定相的粒度大小分别采用干装法和湿装法。装填时要注意让固定相颗粒保持适当的松紧程度。干装法适用于粒度20m的固定相颗粒的填充。颗粒20m用湿装法（浆装法或匀浆法）。有等比重、非等比重两种。常用等比重匀浆法。由于可用作流动相的溶剂很多，不同溶剂的性质（包括极性、浓度、pH值、粘度等）均有较大的差异。因此，适当地选择流动相，就可使样品各组分在两相间分配的差异有较大的变化，从而使分离效果得到很大改善。这也是液相色谱法比气相色谱法优越的条件之一。正确选择流动相的基本原则：稳定性。主要是指柱效率或柱子的保留性质要长期不变。适应所采用的检测器。能溶解待分离样品。清洗方便。粘度要小一些。 重复性差是液固吸附色谱法的重大缺陷。2.2.液液分配色谱法有正向分离和反向分离两种分离形式。正向分离是用极性固定液和非极性流动相来分析极性化合物的色谱系统。反向分离是指用非极性固定液和极性流动相来分析非极性化合物的色谱系统，非极性的样品与固定液有很好的相互作用，它的保留就比极性强。对流动相的要求及选择：流动相尽可能地与固定相不溶。粘度应尽可能小。适应所用检测器的性能。对样品应有选择性。即样品中各组分的值（选择性系数，两个组分的相对校正保留时间之比，=tR2/tR1）不能为1。3、温度控制系统：70以上可以在室温的条件下完成第三章、离心机1、相对离心力(relative centrifugal force，RCF)相对离心力是指在离心力场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度“g”。 由于各种离心机转子的半径或离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力也不同,因此在文献中常用“相对离心力”或“数字g”表示离心力,例如25000g,表示相对离心力为25000。只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。一般情况下,低速离心时相对离心力常以转速“rpm”来表示，高速离心时则以“g”表示。2、沉降系数（sedimentation coefficient）颗粒在单位离心力场作用下的沉降速度，其单位为秒。沉降系数与样品颗粒的分子量、分子密度、组成、形状等都有关，样品颗粒的质量或密度越大，它表现出的沉降系数也越大。各种生物样品的沉降系数差别很大，因此可以应用离心技术来进行其定性和定量的分析及分离制备。3、常用的离心方法：差速离心法，密度梯度离心法，分析型超速离心法（看一下）4、离心机的分类和结构分类：按转速分为可分为低速、高速、超速等离心机 （一）低速离心机是临床实验室常规使用的一类离心机。其最大转速在10000r/min以内，相对离心力在15000 g 以内，容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离。主要用作血浆、血清的分离及脑脊液、胸腹水、尿液等有形成份的分离。（二）高速离心机最大转速为20000rpm25000rpm（r/min）,最大相对离心力为89000g，最大容量可达3升,分离形式是固液沉降分离。主要用于临床实验室分子生物学中的DNA、RNA的分离和基础实验室对各种生物细胞、无机物溶液、悬浮液及胶体溶液的分离、浓缩、提纯样品等。（三）超速离心机转速可达50000rpm80000rpm，相对离心力最大可达510000g，离心容量由几十毫升至2升。分离形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，离心管平衡允许的误差要小于0.1克。为了防止样品液溅出，附有离心管帽；为了防止温度升高，装有冷冻装置。结构：（一） 低速离心机结构较为简单。由电动机（离心机的主件）、离心转盘（45角的斜孔）、调速器、定时器、离心套管、与底座等主要部件构成.（二）高速(冷冻)离心机 通常有转动装置、速度控制系统、温度控制系统、真空系统、离心室、离心转头及安全保护装置等。温度控制系统：制冷压缩机采用全封闭式，由压缩机、冷凝器、毛细管和蒸发器四部分组成。安全保护装置 ：超速离心机的安全保护装置通常包括主电源过电流保护装置、驱动回路超速保护、冷冻机超负荷保护和操作安全保护等四个部分。（三）超速(冷冻)离心机由驱动和速度控制、温度控制、真空系统和转头四个部分组成5、离心机的应用和维护离心机因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用时必须严格遵守操作规程。1. 必须事先平衡离心管和其内容物，要对称放置，转头中绝对不能装载单数的管子，以便使负载均匀地分布在转头的周围。2. 开口离心机不能装载过多溶液，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀。制备型超速离心机的离心管，则要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。3.离心过程中应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常应立即停机检查，及时排除故障。未找出原因前不得继续运转4. 每次使用前要严格检查转头孔内是否有异物和污垢，以保持平衡。每次使用后，都必须仔细检查，并用50 60的温水及中性洗涤剂浸泡清洗或定期用消毒液消毒（每周消毒一次），最后用蒸馏水冲洗，软布擦干后用电吹风吹干、上蜡、干燥保存。每一转头都应有使用档案，若超过了该转头的最高使用时限，则须按规定降速使用。5.控制塑料离心管的使用次数并注意规格配套。离心过程中不得开启离心室盖，不得用手或异物碰撞正在旋转中的转头及离心管。6.低温离心样品时，应先将空的转头在2x10 rpm预冷一定时间，预冷时温度控制在0左右，也可将转头放在冰箱中，预冷数小时备用，离心杯可直接存放在冰箱中预冷。7. 每隔三个月应对离心机主机校正一次水平度，每使用5亿转处理真空泵油一次，每使用1500小时左右，应清洗驱动部位轴承并加上高速润滑油脂，转轴与转头接合部应经常涂酯防锈，长期不用时应涂防锈油加油纸包扎。离心机平时不用时，应每月低速开机1次 2次，每次0.5小时。第四章、光谱分析技术及相关仪器1、朗伯-比尔定律：当用一束单色光照射吸收溶液时，其吸光度与液层厚度及溶液浓度的乘积成正比。其不仅适用于分子分析，也适用于原子分析。 朗伯-比尔定律的适用条件： 1.入射光为单色光。波长范围越大，单色光纯度越低，偏离越大； 2.溶液中邻近分子的存在并不改变每一给定分子的特性，即分子间互不干扰。 3.适用于分子吸收和原子吸收。紫外-可见光光度计的透过率由于读数大小引起误差的情况（画图说明）：（1）当T%读数为36.8%时，浓度测量的相对误差最小。（2）当T%读数在70%-10%,浓度测量的相对误差较小且变化不大，一般为1%-2%。（3）当T%读数小于10%或T%读数大于70%时，浓度测定的相对误差急剧增大，准确度变得很差。2、紫外-可见分光光度计的基本结构示意图 光源 单色器 吸收池 检测器 信号显示系统光源（light source）：提供入射光的装置。要求:1.能在所需波长范围的光谱区域内发射连续光谱； 2.有足够的辐射强度并能长时间稳定。 常用的光源有热辐射灯（钨灯、卤钨灯等），气体放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等。单色器（Monochromator）：是将来自光源的复合光分解为单色光并分离出所需波段光束的装置。是分光光度计的关键部件入射狭缝：限制杂散光进入；色散元件：将复合光分解为单色光，有棱镜和光栅两种；准直镜：将来自色散元件的平行光束聚集在出射狭缝上；出射狭缝：将固定波长范围的光射出单色器，可以限制通带宽度。吸收池（absorption cell）：是用来盛放被测溶液的器件。在可见光区常用无色光学玻璃或塑料制作；在紫外区需用能透紫外线的石英或熔凝石英制作。同一套吸收池的厚度、透光面的透射、反射、折射应严格保持一致。指纹、油污及池壁上的沉淀物都会影响吸收池的透光性能。通过改进吸收池的几何形状，可提高“光程/体积比”，即尽可能延长单位体积的光程。常用的有：微型吸收池（Microdrill absorption cell） ：“光程/体积比”提高了近10倍。 多光路吸收池（Multipie-path absorption cell）：在吸收池壁上装有反射镜，使光线在溶液中经多次反射后才离开吸收池，大大增加了有效光程，提高了测定的灵敏度。检测器：把光信号转换为电信号的装置。对检测器的要求：1.产生的电信号与照射到它上面的光强有恒定的函数关系；2.波长响应范围大；3.灵敏度高； 4.响应速度快，一般要求小于10-8s；5.产生的电信号易于检测、放大，噪声低。检测器工作原理 光照射在某些金属表面，会有光电子从金属表面逸出，这种光电效应称为外光电效应。利用外光电效应可以制成光电管和光电倍增管。光深入到物体内部，将物体内部原子中的一部分束缚电子激发成自由电子，但这些电子并不逸出物体，而是留在物体内部从而使物体导电性增强，称为内光电效应。利用内光电效应可制成光敏电阻、光敏二极管以及光电池。几种常用检测器比较检测器 工 作 原 理 特 点光电管外光电效应简单,灵敏度低光电倍增管外光电效应与多级二次发射体相结合灵敏度比光电管高200多倍光电二极管阵列外光电效应，由一行光敏区和二行读出寄存器构成可同时检测多个波长的光强度。寿命长、光谱响应范围宽、可靠性高、读出速度快光电池内光电效应结实、便宜、使用方便。但产生的电流大小不稳定电荷耦合器件模拟集成电路芯片能同时多谱线检测，极大地提高分析速度信号显示系统: 是把放大的信号以适当的方式显示或记录下来的装置。3、 紫外-可见分光光度计的类型按其光学系统分可分为单波长分光光度计（单光束单波长分光光度计、双光束单波长分光光度计）和双波长分光光度计 （可能填空） 三种类型的优点和不足单波长单光束分光光度计特点 单光束光路，从光源到试样至接收器只有一个光通道； 仪器只有一个色散元件，工作波长范围较窄； 通常采用直接接收放大显示的简单电子系统，用电表或数字显示； 结构简单、附件少、功能范围小，不能做特殊试样如浑浊样品、不透明样品等的测定。 检测准确性不够稳定，不能用于精密分析。 单波长单光束分光光度计光路图（同上要点2）单波长双光束分光光度计在出射狭缝和样品吸收池之间增加了一个光束分裂器或斩波器，用一定的频率将一个光束交替分成两路，使一路经过参比溶液，另一路经过样品溶液，然后由一个检测器交替接收或由两个匹配器分别接收两路信号。 单波长双光束分光光度计特点1.从光源到检测器有试样光路和参考光路两条通路；2.采用两个光栅或棱镜加光栅的双单色器，能有效地提高分辨率和降低杂散光；3.可以自动进行波长扫描、自动记录光谱曲线，也可以外接计算机，实现自动化运行；光源单色器参比池斩光器样品池检测器信号放大系统系统记录仪4.可装备各种附件，功能范围宽。 双波长分光光度法工作原理双波长分光光度法的理论基础是差吸光度和等吸收波长。它采用了两个不同的波长即测量波长和参比波长同时测定一个样品溶液。双波长分光光度计在测定时，两束不同波长的单色光经斩光器（Chopper）处理后，以一定的时间间隔交替照射比色杯，经待测溶液吸收后，再照到光电管上，产生两个不同的吸光度，再将这两个吸光度相减，就得到了差吸光度A。 双波长分光光度计波长选择原则1.被测物在一个波长上有最大吸收峰，在另一个波长上没有吸收或很少吸收；2.非被测物在两个波长上的吸收相同。双波长分光光度计优点只要1、2选择适当，A就是消除了非特征性吸收干扰的吸光度值。将A用于计算结果能较好的解决由于非特征吸收信号（如试样的浑浊、吸收池与空气界面以及吸收池与溶液界面的折射差别等）影响而带来的误差，结果更准确。4、紫外-可见分光光度计性能评价指标（可能名解）(一)波长准确度和波长重复性 波长准确度是指仪器波长指示器上所示波长值与仪器此时实际输出的波长值之间的符合程度波长重复性是指在对同一个吸收带或发射线进行多次测量时，峰值波长测量结果的一致程度。波长误差来源于色散元件传动机构的运动误差、波长度盘的刻划误差、狭缝中心位置偏移和装校误差等。而波长重复性则取决于上述各种机构中间隙的稳定性。(二)光度准确度 光度准确度是指仪器在吸收峰上读出的透射率或吸光度与已知真实透射率或吸光度之间的偏差。该偏差越小，光度准确度越高。(三)光度线性范围 指仪器光度测量系统对于照射到接收器上的辐射功率与系统的测定值之间符合线性关系的功率范围，即仪器的最佳工作范围(四)分辨率 指仪器对于紧密相邻的峰可分辨的最小波长间隔，此间隔越小分辨率越高。它是分光光度计质量的综合反映(五)光谱带宽光谱带宽（Spectral band width）是指从单色器射出的单色光最大强度的1/2处的谱带宽度。它与狭缝宽度、分光元件、准直镜的焦距有关，可以认为是单色器的线色散率的倒数与狭缝宽度的乘积。测量方法：测量钠双线（589.0nm、589.6nm）的宽度。由于元素灯谱线本身的宽度大大小于单色器的宽度，故测得的光谱带宽可以认为就是单色器的光谱带宽。(六)杂散光 除所需波长单色光以外其余所有的光都是杂散光，是测量过程中的主要误差来源，会严重影响检测准确度。(七)基线稳定度是指在不放置样品的情况下，扫描100%T或0%T时读数偏离的程度，是仪器噪声水平的综合反映。一般取最大的峰缝之间的值作为绝对噪声水平。(八)基线平直度是指在不放置样品的情况下，扫描100%T或0%T时基线倾斜或弯曲的程度。在高吸收时，0%线的平直度对读数的影响大；在低吸收时，100%线的平直度对读数的影响大。基线平直度不好，可使样品吸收光谱中各吸收峰间的比值发生变化，给定性分析造成困难。 5、简述用紫外 - 可见光光度计进行样品浓度测定（1）接通电源，打开试样池盖子，预热20-30min,稳定（2）选择适当吸收池（玻璃或石英），保证同一产家；（3）参比池放入光路，注意调“0”和“100”（开盖调0，毕盖调100%），反复多次。（4）测样品时，每改变一个波长，必须进行开盖调0和毕盖调100%（1）使用稀溶液，选用特征波长测定；（2）彻底清洗比色皿；可选择写6、简述用紫外 - 可见光光度计的保管放在适当位置（避光、避潮、远离灰尘和振动） 电源（220V交流稳压电源），未用时拔掉电源 长时间未使用应间断通电预热 保存好操作说明书 保证仪器配件同一批次 保证仪器性能足够好7、 掌握荧光、激发光谱和荧光光谱的定义荧光：物质的分子吸收了照射光的能量后，处于基态最低能级的分子被激发到第一电子激发态和其它电子激发态的各个振动能级。到达激发态的各个振动能级的分子，和周围的分子（如溶剂分子）碰撞，并把部分能量以热能的形式传给周围的分子，自己降落到单线第二电子激发态的最低振动能级。然后，由此最低振动能级向基态的各个振动能级跃迁，同时以发光的形式释放出其能量。这种光即为荧光。任何发射荧光的物质都具有两个特征光谱，即激发光谱（excitation spectrum）和荧光光谱(fluorescence spectrum)。它们是荧光分析中定性和定量的基础。激发光谱：将激发光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长的激发光照射下，物质溶液发射的荧光强度的变化。以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，即可得到荧光物质的激发光谱。从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长ex。荧光光谱：用ex作激发光源，并固定强度，让物质发射的荧光通过单色器分光，测定不同波长的荧光强度。以荧光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，便得荧光光谱。荧光光谱中荧光强度最强的波长为 em 。荧光物质的ex和em是鉴定物质的根据，也是定量测定中所选用的最灵敏的波长。8、荧光光谱仪的主要结构激光光源：激发样品中荧光分子产生荧光。常用汞弧灯、氢弧灯及氘灯等。单