第九章免疫标记技术

第四章 免疫标记技术,免疫标记技术 （immunolabelling technique）,用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。,免疫标记技术,分类：免疫酶技术(ng)、放射免疫技术(pg)、免疫荧光技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术、发光免疫测定。 特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位,第八章 免疫标记技术,第一节 放射免疫技术 第二节 免疫荧光技术 第三节 酶免疫技术 第四节 其他免疫标记技术,第八章 免疫标记技术,第一节 放射免疫技术 第二节 免疫荧光技术 第三节 酶免疫技术 第四节 其他免疫标记技术,第一节 放射免疫技术,一、放射免疫技术的原理 二、放射免疫技术的基本条件 三、放射免疫技术的基本类型,放射免疫技术 （radioimmunoassay，RIA）,（1977年获诺贝尔生理和医学奖）,1986年Miles和Hales建立免疫放射分析技术（immunoradiometric assay，IRMA） 标记抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，待测物（或标准品）和同位素标记抗体全量反应。 优点： 灵敏度高（可提高6-10倍）、准确度高、重复性好、检样量少 缺点： 干扰因素较多、检测仪器贵、有放射性污染,免疫放射技术 （immunoradiometric assay，IRMA）,第一节 放射免疫技术,一、放射免疫技术的原理 二、放射免疫技术的基本条件 三、放射免疫技术的基本类型,一、放射免疫技术的原理,RIA是以放射性同位素标记抗原的一种竞争性免疫抑制试验,第一节 放射免疫技术,一、放射免疫技术的原理 二、放射免疫技术的基本条件 三、放射免疫技术的基本类型,二、放射免疫技术的基本条件,1抗原标准品与待测抗原 2特异性抗体 3放射性同位素 4常用的同位素标记方法 5B与F的分离技术,1抗原标准品与待测抗原,标准品是放免技术的定量依据 标准品：与待测样品的化学结构完全相同 替代品：与待测样品的结构相似，但要与抗体的亲和力相近，应列出与真标准品的换算系数。,2. 特异性抗体,放射免疫技术的抗体应具备： 特异性高、亲和力高（平衡常数K值大）、效价高,（即抗血清高度稀释时仍能迅速与抗原结合，极少解离，保证检测的灵敏度）,3. 放射性同位素,4. 常用的同位素标记方法,氯胺T氧化标记法 乳过氧化物酶标记法,5. B与F的分离技术,（1）双抗体沉淀分离法 （2）化学试剂分段沉淀分离法 （3）固相法 （4）吸附法,结合态标记抗原B与游离态标记抗原F能否有效地分离是放射免疫技术的一个重要环节。,分离剂的要求,能使B和F完全分离 不受外界因素的干扰 与游离抗原的非特异性作用尽可能小 操作简便、分离迅速、重复性好 来源广，经济，便于使用,（1）双抗体沉淀分离法,优点： 本法操作简便、稳定 缺点： 易受免疫反应液中其他蛋白质或盐的干扰，使非特异性吸附有较大变异，且第二抗体消耗量大。,加入第二抗体使微量抗原抗体复合物的分子加大，从而使原来不能用普通离心法沉淀的抗原抗体复合物易于沉淀而分离。 本法为目前应用最广泛的分析方法,（2）化学试剂分段沉淀分离法,利用盐类或有机化合物使反应液中的-球蛋白在等电点沉淀，从而达到分离的目的。如：聚乙二醇（PEG）、硫酸铵等,优点： 试剂来源广泛、 价格便宜 缺点： 影响因素多（温度、pH值、浓度等）,（3）固相法,将测定用的第一抗体（或第二抗体）牢固地结合于固相载体表面，相应抗原（或第一抗体）经温育被吸附，只要将固相表面洗涤即将B和F分离。 优点：操作简便、快速 新的固相分离方法： 纤维固相抗体竞争法 可磁化颗粒固相抗体竞争法 试管固相法,（4）吸附法,本法多用于小分子半抗原的放射免疫分析。,如：活性炭、硅镁吸附剂、滑石粉等 性质：对蛋白质、多肽、药物等具有非特异性 吸附的能力 应用：在其表面包被一层白蛋白或右旋糖苷等 物质时，将会限制大分子物质的吸附。 沉 淀 中：吸附有游离的抗原或半抗原 上清液中：抗原抗体复合物,优点：操作简便、分离迅速 缺点：专一性不强,第一节 放射免疫技术,一、放射免疫技术的原理 二、放射免疫技术的基本条件 三、放射免疫技术的基本类型,三、放射免疫技术的基本类型,1. RIA法 2. 经典IRMA法 3. 双抗体夹心法 4. 二抗标记法 5. 双标记抗体法,1. RIA法,2. 经典IRMA法,3. 双抗体夹心法,标记,4. 二抗标记法,5. 双标记抗体法,双标记抗体是将两种针对不同表位的抗体（Ab2、Ab3）标记上不同的同位素，可以用不同的检测仪进行测定。,第八章 免疫标记技术,第一节 放射免疫技术 第二节 免疫荧光技术 第三节 酶免疫技术 第四节 其他免疫标记技术,一、免疫荧光技术的原理 二、免疫荧光技术的基本条件 三、免疫荧光技术的基本类型,第二节 免疫荧光技术,一、免疫荧光技术的原理 二、免疫荧光技术的基本条件 三、免疫荧光技术的基本类型,第二节 免疫荧光技术,Albert Hewett Coons（19121978）,20世纪40年代Coons等首先用荧光素FITC标记抗体，成功地检测了小鼠肺脏组织内存在的肺炎双球菌多糖抗原，从而创建免疫荧光技术（ immuno-fluorescence technique ）。,一、免疫荧光技术的原理,三结合： 抗原抗体反应的高度特异性 荧光的敏感可测性 显微技术的高度精确性 优点： 特异性强、敏感性高、速度快，结果直观，可以检测和定位微量抗原 缺点： 荧光易发生淬灭，荧光染色标本保存困难、易出现非特异性染色问题，镜检结果判定客观性不足,一、免疫荧光技术的原理 二、免疫荧光技术的基本条件 三、免疫荧光技术的基本类型,第二节 免疫荧光技术,1. 荧光素 2. 荧光标记物的制备 荧光检测仪,二、免疫荧光技术的基本条件,1. 荧光素 2. 荧光标记物的制备 荧光检测仪,二、免疫荧光技术的基本条件,1荧光素,荧光素：可以产生明亮荧光的染色物质,荧光素的性质,吸收光后电子跃迁 保持固有的荧光特性 荧光的波长总是大于激发光波长（STOKES 法则） 荧光强度小于激发光的强度,荧光效率=发射光量子数/吸收光量子数100% 荧光强度=吸收光量子数荧光效率,荧光的种类,自发荧光,二次荧光,非特异性荧光： 自发荧光 诱发荧光 酶诱发荧光,常用的荧光素,1. 荧光素 2. 荧光标记物的制备 荧光检测仪,二、免疫荧光技术的基本条件,2. 荧光标记物的制备,（1）搅拌标记法（Marshall法） （2）半透膜透析标记法（Clark法）,1. 荧光素 2. 荧光标记物的制备 荧光检测仪,二、免疫荧光技术的基本条件,3. 荧光检测仪,（1） 荧光显微镜 （2） 荧光分光光度计 （3） 流式细胞术 （4） 荧光偏振免疫分析技术 （5） 时间分辨荧光免疫测定,（1）荧光显微镜,（a）光源： 150200W高压汞灯 （b）滤光系统,荧光显微镜,荧光显微镜的种类 透射式 落射式,荧光显微镜的主要部件,透射式 汞灯光源 激发滤色镜 吸收滤色镜 暗场聚光镜,落射式 汞灯光源 激发滤色镜 分色镜 吸收滤色镜,返回,落射荧光显微镜的构造,激发滤光板,位于聚光镜和光源之间，可滤过由荧光灯源发射出的其他光，只允许波长为275480nm的紫外光（MG）和蓝紫光（BG）通过，以激发荧光结合物发射荧光。,落射荧光显微镜各部件特性和作用,汞灯光源: 提供激发光(U、V、B、G),激发滤色镜: 波长选择,nm,T%,BAND PASS,落射荧光显微镜各部件特性和作用,吸收滤色镜: 透过荧光,阻挡杂光,分色镜: 反射激发光,透过荧光,A 透过,A,A 反射,B,B 透过,B 阻挡,nm,nm,T%,T%,吸收滤光板,安装在物镜后面的光通路上，其作用是只允许荧光通过，阻止紫外光和蓝紫光通过，从而使观测标本在暗的背景下，呈现明亮的荧光，便于观察。,吸收滤光板,吸收滤光板的透光波长范围是410650nm，代号有OG（橙黄色）和GG（淡绿黄色）两种。,FITC结合物一般可用激发滤光板BG12与吸收滤光板OG4或GG9 RB200结合物一般可用激发滤光板BG12与吸收滤光板OG5,落射荧光显微镜原理,汞 灯,激发滤色镜,分色镜,吸收滤色镜,物 镜,标 本,（3）流式细胞仪,流式细胞仪（Flow cytometry，FCM） 或荧光激活细胞分类器（fluorescing activating cell sorter，FACS）,FCM是目前分析细胞学最具代表性的先进仪器，是流体喷射技术、激光技术、-射线能谱技术、电子计算机以及显微荧光分光光度计等高技术密切结合的高级精密仪器。,（1）样品处理和输出系统 （2）光子和物理参数检测系统 （3）电子读数和数据处理系统,4.66%,2.93%,0.65%,1.48%,FITC,PI,一、免疫荧光技术的原理 二、免疫荧光技术的基本条件 三、免疫荧光技术的基本类型,第二节 免疫荧光技术,1. 直接荧光抗体染色法 2. 间接荧光抗体染色法 补体荧光染色法 特殊染色法,三、免疫荧光技术的基本类型,1. 直接荧光抗体染色法 2. 间接荧光抗体染色法 补体荧光染色法 特殊染色法,三、免疫荧光技术的基本类型,1. 直接荧光抗体染色法,优点： 简单、快速、特异性高 缺点： 检测每种抗原需制备相应抗体、敏感性差,将荧光素标记在特异性抗体上，直接检测抗原,1. 直接荧光抗体染色法 2. 间接荧光抗体染色法 补体荧光染色法 特殊染色法,三、免疫荧光技术的基本类型,2. 间接荧光抗体染色法,优点： 敏感性高、一种二抗可检测多种抗原抗体系统 缺点： 干扰因素多、操作流程长,将荧光素标记在第二抗体（抗抗体）上或标记在SPA上，检测与抗原结合的特异性抗体,1. 直接荧光抗体染色法 2. 间接荧光抗体染色法 补体荧光染色法 特殊染色法,三、免疫荧光技术的基本类型,3. 补体荧光染色法,优点： 可检测所有抗原抗体系统，具有通用性；敏感性高 缺点： 操作过程较复杂，干扰因素多，易出现非特异性染色，补体易失活,将荧光素标记在补体的抗体上（抗C3抗体），检测抗原抗体复合物。,1. 直接荧光抗体染色法 2. 间接荧光抗体染色法 补体荧光染色法 特殊染色法,三、免疫荧光技术的基本类型,4特殊染色法,（1）双标记免疫荧光技术 （2）双色免疫荧光技术 （3）反衬染色法,（1）双标记免疫荧光技术,在同一标本中，可用两种不同颜色的荧光标记抗体进行染色，同时显示两种不同的细胞或同一细胞上不同的抗原。 如：FITC（黄绿色荧光）标记Ab1 RB200或TRITC9（桔红色荧光）标记Ab2,细胞内双标记荧光染色,DAPI+FITC,FITC+PI,（2）双色免疫荧光技术,如FITC标记抗体和细胞核染色剂PI（红色）DAPI（蓝色）,（3）反衬染色法,是用一种非特异染色来反衬一种免疫荧光试剂的特异性染色。 如：用RB200标记BSA作为非特异性反衬标记，用FITC标记特异性抗体。,（3）反衬染色法,采用一种非特异性染色来反衬另一种免疫荧光试剂的特异性染色. 如：用RB200标记牛血清白蛋白作为非特异性反衬用FITC标记特异性抗体对抗原物的染色。,第八章 免疫标记技术,第一节 放射免疫技术 第二节 免疫荧光技术 第三节 酶免疫技术 第四节 其他免疫标记技术,一、酶免疫技术的原理 二、酶免疫技术的基本条件 三、酶免疫技术的基本类型,第三节 酶免疫技术,一、酶免疫技术的原理 二、酶免疫技术的基本条件 三、酶免疫技术的基本类型,第三节 酶免疫技术,酶催化反应原理,酶催化反应的两种基本形式： E+S（ES） E+P E+S（ES） + D1 E + P + D2 E：酶 S：酶作用的底物 P：底物分解后的产物（有色化合物） D1：供氢体 D2：为D1的氧化型（有色化合物）,酶免疫技术 （enzyme immunoassay，EIA）,优点： 灵敏度高，特异性强，操作简便，易掌握和推广；试剂易制备，且稳定保存期长；结果可肉眼观察，也可用仪器定量检测，且仪器价格较低廉。 缺点： 检测可溶性样品，灵敏度和重复性不及放免疫测定法；免疫组化中，易受细胞内源性酶的干扰，直观性比荧光免疫染色法差。,一、酶免疫技术的原理 二、酶免疫技术的基本条件 三、酶免疫技术的基本类型,第三节 酶免疫技术,二、酶免疫技术的基本条件,1标记酶 2酶标记物的制备 3酶底物的选择 4 . 固相载体的选择 5 . 酶标检测仪,二、酶免疫技术的基本条件,1标记酶 2酶标记物的制备 3酶底物的选择 4 . 固相载体的选择 5 . 酶标检测仪,1. 标记酶,辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase，HRP） 碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，AP） 葡萄糖氧化酶 （glucooxidase，Glu） -D-半乳糖苷酶 （-D-galactosidase，-D-Gal）,二、酶免疫技术的基本条件,1标记酶 2酶标记物的制备 3酶底物的选择 4 . 固相载体的选择 5 . 酶标检测仪,酶标记物的制备,免疫酶结合物： 酶标记抗原的制备 酶标记抗体的制备,戊二醛交联法,即将标记酶通过具有双功能或多功能化学基团的交联剂连接到抗原或抗体分子上。,过碘酸氧化交联法,将酶分子氧化产生活性基团，再与抗原或抗体分子结合，使之成为与相应靶分子具有特异性结合活性的酶标抗原或抗体。,二、酶免疫技术的基本条件,1标记酶 2酶标记物的制备 3酶底物的选择 4 . 固相载体的选择 5 . 酶标检测仪,3. 酶底物的选择,二、酶免疫技术的基本条件,1标记酶 2酶标记物的制备 3酶底物的选择 4 . 固相载体的选择 5 . 酶标检测仪,4. 固相载体的选择,ELISA法最常用的固相载体： 要求：蛋白质吸附性能强、吸附后不影响抗原抗体的活性、价格低廉、形状可塑 聚苯乙烯吸附性能好、透明度好 聚氯乙烯质软板薄，容易剪割，价廉，吸附性能高于聚苯乙烯，但光洁度稍差、空白值也略高 硝酸纤维素膜及微孔滤膜用于快速斑点免疫结合试验,二、酶免疫技术的基本条件,1标记酶 2酶标记物的制备 3酶底物的选择 4 . 固相载体的选择 5 . 酶标检测仪,一、酶免疫技术的原理 二、酶免疫技术的基本条件 三、酶免疫技术的基本类型,第三节 酶免疫技术,三、免疫酶技术的类型,酶联免疫吸附试验 （enzyme linked immunosorbent，ELISA）,酶联免疫吸附试验 （Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）,1. 直接法 2. 间接法 3. 夹心法 4. 竞争法 5. 抗酶抗体法 6. 酶联免疫荧光测定法 7. ELISPOT,ELISA的检测类型,1. 直接法,2. 间接法,3. 夹心法,4. 竞争法,5. 抗酶抗体法,6. 酶联免疫荧光测定法,荧光底物使ELISA的检测极限提高了几十倍，达到渺克（ag=10-18g）水平,7. ELISPOT,ELISA实验条件优化,蛋白的包被：载体、蛋白浓度、温度、时间 封阻：BSA、血清、脱脂奶粉 洗涤：生理盐水、PBS、Tris-HCl 酶结合物的浓度：标准为OD值1.0 标本的选择 结果判断,第八章 免疫标记技术,第一节 放射免疫技术 第二节 免疫荧光技术 第三节 酶免疫技术 第四节 其他免疫标记技术,一、生物素-亲和素放大系统 二、免疫分析技术中的通用系统 SPA通用系统,第四节 其他免疫标记技术,一、生物素-亲和素放大系统 二、免疫分析技术中的通用系统 SPA通用系统,第四节 其他免疫标记技术,生物素-亲合素系统 （Biotin-avidin system，BAS）,1980年，Hsu首先用生物素亲合素化酶进行组织化学研究 1983年，Yolken和Kendall首次用BAS与ELISA相结合检测特异性抗原和抗体，并获得成功 BSA与酶、同位素、荧光素等标记技术有机结合，可使各种示踪免疫分析的灵敏度进一步提高，可用于微量蛋白分子的定量检测。,生物素（biotin，B）,生物素分子式为C10H16O3N2S，分子量为244.31，pI为3.5。可从含量较高的卵黄（型）和肝组织（型）中提取，也可合成。,亲合素（avidin，A）,A是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白 pI 1010.5 MW68,000 由4个亚单位组成,Ka = 1015mol/L 1个A与4个B结合,又称卵白蛋白、抗生物素,链霉亲和素 （streptavidin，SA）,在结构上因不含有任何糖基，因此在测定中的非特异性远低于亲合素。,SA是由Streptomyces avidin菌分泌的一种略偏酸性蛋白质 MW 65,000 pI 6.0 SA不含任何糖基,Ka = 1015mol/L 1个A与4个B结合,生物素-亲合素标记技术,生物素的活化 生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯（BNHS）羧基与蛋白质赖氨酸上的氨基以酰胺键偶联、常用于标记抗体及中性偏碱的抗原 长臂活化生物素（BCNHS）更易与抗体、酶等生物大分子结合而发挥效应 生物素酰肼（BHZ）主要用于标记偏酸性糖