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改善微循环保健类（功能试验）（动物试验）微循环是血液与组织细胞物质交换、保障新陈代谢的场所。在微循环障碍中血瘀证最常见，以疼痛、肿块、瘀斑为主要特征，其与血液循环、高黏滞状态、血小板功能、血栓形成等多种改变有关。因此改善微循环的保健用品应以活血化瘀、疏通血脉、祛除血瘀为主要功能。一、功效学研究思路：主以活血化瘀、疏通血脉、祛除血瘀；兼以镇痛、消肿、抗炎、止痒和恢复功能。二、试验模型和方法主要表现为血液流变学异常、微循环障碍、血流动力学异常等方面。 活血化瘀的主要药理作用有以下几个方面： 1扩张血管、增加器官血流量 研究对靶器官血管和血流量的作用。 2改善血液流变学 血瘀证一般有血液“浓、黏、凝、聚”等血液流变学异常的倾向或表现。应研究改善血瘀状态下血液的“浓、黏、凝、聚”状态。 3抗血栓形成 研究受试物的改善血液流变学特性，减少血小板的黏着和聚集；降低血小板的表面活性，抑制血小板黏附、聚集和释放反应等；抗凝，改善血瘀证高凝状态；升高血管壁内前列腺环素，阻止血小板在血管壁聚集和血栓形成；增加纤溶酶活性，促进已形成的纤维蛋白溶解。 4改善微循环 研究受试品的作用机制：改善微血流，使流动缓慢的血流加速。改善微血管形态，解除微血管痉挛，减轻红细胞的瘀滞和汇集、减少微循环瘀血。降低毛细血管通透性，减少微血管周围渗血。5其他作用 如：降血压，改善机体状态，调节组织修复再生，抗炎，镇痛等。毛细血管通透性试验：染料的浓度。三、注意事项：本类保健用品至少选用2个以上试验项目，证明受试物对微循环的改善作用。改善微循环保健类（人体试验）缓解腰痛人体试验（肩、膝、踝、肘关节痛可根据保健用品的作用部位参照此标准）一、功效指标（观察项目）1腰骶痛或不适（VAS评分）。2腰骶部晨僵。3臀部、腹股沟部酸痛。4症状有无向下肢放射。5疼痛和静止、休息时以及活动的关系。6疼痛影响睡眠的程度。7对腰部活动功能的改善程度。8缓解疼痛的起效时间和相应的人数比例。9疼痛消失的时间及相应的人数比例。10随访二、结果判定1试验组使用前后自身比较，原有部位疼痛明显减轻，VAS评分平均下降2.5分及其以上且有统计学差异；2试验组与对照组组间比较，试验组原有部位疼痛明显减轻，VAS评分比对照组平均低2.5分及其以上且有统计学差异；3其他症状及体征有一定程度的改善；4总有效率65%以上，愈显率大于35% 。满足上述1、2、4项的标准，可判定该受试物对缓解腰痛及相应部位的关节痛及活动不利有保健作用。保健用品安全性试验方法一、皮肤急性毒性试验1.试验材料1.1动物：白色兔、白色豚鼠、大鼠。兔体重1.8Kg以上；豚鼠250-350g；大鼠180-210g。受试动物应皮肤光滑，无损伤，无皮肤病。1.2受试物：如为膏剂或者液体剂型。可直接涂抹于去毛皮肤上。若受试物是固体粉末或散剂，则需加适量水或者适当的赋形剂（如羊毛脂、凡士林、橄榄油等）混匀，以保证受试动物与皮肤良好接触。2试验方法2.1 皮肤准备：在实验前24h，将动物背部脊柱两侧去毛（采用剪、剃或适宜的脱毛剂）。兔约150CM2。豚鼠和大鼠约40CM2。2.2 给受试物方法：受试物涂抹后以适当的方法固定，如无刺激性纱布、胶布或有孔尼龙绷带固定。大鼠或豚鼠也可用适当大小的橡皮套（剪去手指的橡皮手套）把整个背部和腹部包住。如受试物是液体，则应在其上敷以聚乙烯薄膜，然后再包扎固定，以防止液体挥发，实验过程中，要注意防止动物舔食受试物。2.3 剂量和分组：一般分3个剂量组，其中一个为赋形剂对照组，两个给受试物组，高剂量组剂量为低剂量的510倍。为了提高给受试物剂量可提高浓度或增加24h内给受试物次数。如果受试物毒性较小，提高剂量不能引起动物出现明显毒性症状，可只设一个剂量组。大鼠或豚鼠每组10只，兔每组4只，雄雌各半。2.4 观察：动物分笼饲养。给受试物后24h，如未中毒死亡，可用温水或其他的无刺激性溶剂除去残留于皮肤的受试物或赋形剂。继续观察，连续7d，注意动物的全身中毒表现和死亡情况。毒性症状的观察项目：外观行为、异常运动、精神状态、食欲、大便、肤色、呼吸、异常分泌物等，如有动物死亡，应立即进行尸检和肉眼观察，当有肉眼可见病变时，则应进行病理组织学检查。2.5 结果评价：见表1 表1 皮肤急性毒性试验结果评价标准组别兔涂皮LD50（mg/Kg）极毒剧毒中等毒低毒实际无毒554444350350218021803实验报告3.1 实验设计：动物种属、品系、规格、试验方法和皮肤去毛面积、受试物剂量，固定方法等。3.2 试验结果：列表表示分组、剂量、动物数、死亡数及急性中毒症状.3.3 根据试验结果的综合评价。二、皮肤长期毒性试验1材料1.1 动物：选用兔、豚鼠或大鼠。兔体重1.8Kg以上；豚鼠250-350g；大鼠180-210g。受试动物应皮肤光滑，无损伤。1.2 受试物：同皮肤急性毒性试验1.22试验方法2.1 剂量和分组：一般设高、低两个剂量组，和一个对照组。皮肤给受试物的高剂量组应是使动物产生严重中毒性反应或者有少数动物死亡剂量，低剂量组应当相当或略高于功效学的有效剂量。但如皮肤急性毒性试验剂量超过临床用量20倍而未出现毒性反应及死亡者，可设一个相当于临床20倍以上的高剂量组和一个对照组。每组兔不少于6只，大鼠或豚鼠每组不少于10只。2.2 动物皮肤给受试物方法：皮肤准备、涂抹受试物和固定方法按皮肤急性毒性试验2.1，每周受试物7次，每日1次，每次至少接触6小时。2.3 试验周期，给受试物时间不少于使用周期的两倍。2.4 观察和结果：给受试物停止后，留下部分（约1/3）动物继续观察2周，观察毒性反应可逆程度，其他动物全部处死。并作血液学生化学和病理学检查，血液学指标：应检查红细胞、白细胞数，血红蛋白，白细胞分类。急性毒性试验未发现明显毒性者，可简化为检查红、白细胞计数，白细胞分类和血红蛋白测定。血液生化学指标：应检查天门冬氨酸基转氨酶，丙氨酸氨基转氨酶，碱性磷酸酶，尿素氮，总蛋白，血糖，总胆红素，肌酐，总胆固醇。急性毒性试验未发现明显中毒者，至少应检查肝、肾功能各两项敏感指标。病理组织学检查：心、肝、肺、脾、肾、肾上腺、胰腺、胃、小肠、大肠、卵巢、子宫、睾丸、附睾、脑、眼结膜、角膜、皮肤、胸骨、受试部位的皮肤及皮下组织取材后立即放进10%福尔马林固定。可先作高剂量组和对照组的组织学检查，其他剂量组可取材10%福尔马林固定保存，在高剂量组有异常时再进行检查。但病理组织学检查中，受试物涂抹的局部皮肤应列为检查的一个重要对象。3.试验报告3.1 试验设计：动物品种、规格、皮肤准备、剂量分组、给受试物周期，观察指标等。3.2 试验结果整理：包括检查观察的项目和结果，列表表示，并进行统计学处理，与对照比较的显著性差异情况。对病理学检查结果的客观描述。3.3 根据以上结果对受试物长期毒性进行评价。三、皮肤刺激性试验1 材料1.1 动物：选用兔或豚鼠、大鼠。兔体重1.8Kg以上；豚鼠250-350g。兔4只，豚鼠6只，雌雄各半。1.2 受试物：同皮肤急性毒性试验1.2。2试验方法2.1 皮肤急性刺激试验（一次皮肤涂抹试验）：a) 给受试物前24h，动物背部脊柱两侧毛剪掉，切勿引起皮肤损伤。采用左、右侧自身对照，分受试物区和对照区，每区去毛范围左、右各约3cm6cm。各区之间应保留适当距离。涂抹受试物一定剂量，对照区涂等量赋形剂。用油纸和二层纱布覆盖，适当方法固定。24h后以温水或无刺激性溶剂去除残留受试物及赋形剂。再经1.24.48和72h观察涂抹部位的红斑和水肿等反应。b)结果判断与评价：每只动物试验结果按表2进行刺激反应评分，计算出平均分值并按表3进行刺激强度评价。刺激强度评价以其最高刺激强度为准。表2 皮肤急性刺激试验评价标准（1）刺激反应分值红斑：无红斑勉强可见中度红斑严重红斑紫红色红斑并有焦痂形成水肿：无水肿勉强可见轻度可见（边缘高出周围皮肤）皮肤隆起约1mm轮廓清楚水肿隆起1mm以上并范围扩大0123401234最高总分值8 表3 皮肤急性刺激试验评价标准（2）刺激强度平均分值无刺激性轻度刺激性中度刺激性强度刺激性0.00.490.52.993.05.996.08.0c) 试验报告：1) 试验设计：包括动物种属、品系、去毛区面积、受试物和对照物。受试物涂抹部位和作用时间。2) 试验结果：每只动物的反应分值和平均分值，列表表示。3)判断：根据试验结果判定受试物对皮肤的刺激性强度，以及刺激反应的发展和恢复情况。2.2皮肤慢性刺激试验（多次皮肤涂抹试验）：a) 先将实验动物背部脊柱两侧皮肤的毛剪掉，去毛范围各为3cm6cm。取受试物一定剂量，涂抹在一侧，另一侧涂等量赋形剂作为对照，每天涂抹12次，连续涂抹14天。每天涂前应剪毛，不得损伤皮肤，保证受试物与皮肤充分接触。每天观察皮肤反应，按表2评分。脱屑积分为1。最高刺激指数为14（观察次数）8（总积分数）=112。实验结束，用角膜环钻取涂抹部位皮肤进行病理组织学检查，按表4评分。b) 结果评价：按上述评定标准和指标的最高分值判断受试物的皮肤刺激作用的有无或刺激的强弱，多次皮肤刺激性试验刺激指数超过30、病理组织检查积分超过4，应判断受试物对皮肤有明显刺激性。c) 试验报告：内容同皮肤急性刺激试验。表4 皮肤慢性刺激试验（多次皮肤涂抹试验）评价标准皮肤改变积分最高1. 刺层肥厚（a） 棘层肥厚轻度（表皮为正常厚度1.53倍）中度（表皮为正常厚度34倍）重度（表皮为正常厚度4倍）21332. 角化过度（b）颗粒层增厚（c）角化不全11113. 其他表皮改变（d）颗粒层缺乏(e) 角化不全 (f) 表皮细胞空泡化或细胞内水肿或基底细胞液化变性(g) 海绵形成棘细胞间水肿水泡形成1111211124. 表皮坏死（h）表皮坏死轻度（占表皮切面的1/3以下）中度（占表皮切面的1/32/3）重度（占表皮切面的2/3以上）81015155. 真皮变化（i）真皮结缔组织血管扩张充血或水肿 (j) 胶原纤维变性或解离(k) 真皮炎性细胞浸润 轻度 中度 重度11123113注：总分按（a+b+c+d+e+f+g）或（h）+(i+j+h)选择总分较大者。解离系指胶原纤维分离成细小碎片。四、 皮肤过敏性试验1试验材料1.1 动物：白色豚鼠30只，体重250350g，雌雄各半。在给受试物前24小时，将豚鼠背部两侧去毛，去毛范围每侧约33cm2。1.2 受试物：如为固体粉末，需用适量的赋形剂混匀，以保证受试物与皮肤的良好接触。如受试物是液体或半固体的膏剂，可直接用于试验。2试验方法2.1 实验分组：将豚鼠按体重、性别随机分成三组，每组10只，雌雄各半。第一组给受试物；第二组阴性对照，给赋形剂；第三组阳性对照，给予适当浓度的2.4-二硝基氯苯（DNCB）。2.2 致敏接触：取受试物一定剂量，涂在动物左侧背部脱毛区，用适宜方法固定，每只动物分笼饲养，持续6小时。第7天和第14天，以同样方法重复一次。阴性对照组动物涂赋形剂；阳性对照组动物涂1%DNCB，方法同受试物组。2.3 激发接触：于末次给受试物致敏后14天，将受试物一定剂量涂于豚鼠背部右侧脱毛区，6小时后去掉受试物。即刻观察皮肤过敏反应情况，然后于24、48、72小时再次观察。阴性涂赋性剂、阳性对照组涂0.1%DNCB。3.结果判断与评价3.1 每个动物的试验结果均按表5皮肤过敏反应评分标准评分，并计算各组动物的反应平均值。反应平均值=（红斑形成总分+水肿形成总分）/合计动物数根据试验组与对照组豚鼠皮肤反应的差别，判断受试物对皮肤过敏反应的性质。3.2 按表6判断受试物的致敏率。致敏率的计算是：将出现皮肤过敏反应阳性（不论程度轻重）的动物例数除以受试动物总数。表5 皮肤过敏试验结果评价标准皮肤反应分值红斑形成无红斑轻度红斑，勉强可见中度红斑，明显可见重并红斑紫红色斑并有焦痂形成01234消肿形成无水肿轻度水肿，勉强可见中度水肿，皮肤隆起1mm，轮廓清楚严重水肿，皮肤隆起1mm以上，并有扩大或有水泡或破溃0134最高总分值8表6 皮肤过敏试验结果评价标准致敏率致敏反应强度01011303160618081100无致敏性轻度致敏性中度致敏性高度致敏性极度致敏性4.试验报告4.1 试验设计：动物品种、规格、受试物、阳性对照物。试验方法，分组、致敏和激发过程。4.2 试验结果：列表表示各组动物在不同时间内，致敏试验反应情况及其致敏率。4.3 判断：根据试验结果判定对皮肤的致敏反应强度。五、皮肤斑贴试验（人体）1皮肤斑贴试验方法的原则1.1实验全过程包括诱导期、中间休止期及激发期。1.2受试物（可疑致敏原）与皮肤有充分接触时间。1.3选择合适敏感斑贴部位，如人体上背部或前臂屈侧皮肤。1.4受试者应无过敏史，样本数不少于25人。1.5 实验前应向受试者详细介绍实验目的和方法，并取得伦理委员会的许可，以取得圆满合作。2试验方法2.1 将5%十二烷基硫酸钠（SLS）液0.1ml滴在2cm2cm大小的四层纱布上，然后敷贴在受试者上背部或前臂屈侧皮肤上，再用玻璃纸覆盖，用无刺激胶布固定。24小时后将覆贴物去掉，皮肤应出现中度红斑反应。如无反应，调节SLS浓度或再重复一次。2.2 将0.2ml（g）受试物按上述方法覆贴在同一部位上，固定48小时后，去掉斑贴物，休息一日。2.3 重复2.2步骤，共四次。如试验中皮肤出现明显反应，诱导可停止。2.4 于最后一次诱导两周，选择未做过斑贴上背部或前臂屈侧皮肤两块，间距3cm，一块作对照，一块敷贴含上受试物0.2 ml（g）的1cm1cm纱布，封闭固定48小时后，去除斑贴物，立即观察皮肤反应，24、48和72小时再观察皮肤反应的发展或消失情况，按表7和表8进行皮肤反应评定。表7 皮肤斑贴试验（人体）评价标准1皮肤反应分级无反应红斑和轻度水肿、偶见丘疹浸润红斑、丘疹窿起、偶而可见水疱明显浸润红斑、大小水疱融合0123表8 皮肤斑贴试验（人体）评价标准2致敏比例分级分类02/2537/25813/251420/252125/2512345弱致敏原轻度致敏原中度致敏原强致敏原极强致敏原3结果评定如人体斑贴试验表明受试物为轻度致敏原，可作出禁止生产和销售的评价。六、致突变试验1. 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）。1.1菌株：常用组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（Samone11atyphimurium）TA98、TA100、TA97和TA102，经检定符合要求，-80或液氮冻存备用。1.2剂量：至少应采用五种不同剂量。决定受试物最高剂量的限制因素，是对细菌的毒性和溶解度。是最剂量一般采用5mg/皿，最低剂量一般为1g/皿或0.1g/皿。但如果受试物达某一浓度时，对细菌生长有抑制作用，则该剂量不宜作本试验，应弃去不用。1.3 代谢活化：应用诱导剂混合物处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（S9），进行体外代谢活化试验，即在加S9和不加S9平行条件下测试。1.4 对照：阴性、阳性对照和S9对照。原则上阴性对照为溶剂对照，阳性对照为已知阳性致突变剂，如敌克松（Dexon）对照。1.5 测试：标准平板法或予培养法，48h观察结果，检查诱发的回复突变菌落数。每一浓度至少三皿，求出平均值。1.6 判定：受试物诱发的回复突变菌落数，超过阴性对照组2倍以上，并有剂量依赖关系者，判定为阳性。2 .哺乳动物培养细胞染色体畸变试验。2.1 细胞：哺乳动物原代或传代培养细胞。建议首选中国仓鼠肺细胞（CHL）。2.2 剂量：至少用三种不同剂量进行测试。一般以50细胞生长抑制浓度（ID50）为测试的最高剂量。为此，在测试之前，应测定受试物对培养细胞ID50，以药物作用48h为准。受试物最大浓度不超过10mM。用倍量稀释法确定中、低剂量。2.3 代谢活化：应用诱导剂处理后的哺乳动物肺微粒体酶（S9），进行体外代谢活化试验，即在加S9mix和不加S9mix平行的条件下测试。2.4 药物作用时间：药物和细胞需接触适当时间后进行观察。非活化一般在接触24 h 和48h后收获细胞，代谢活化作用6h以上。2.5 标本制作时间：药物和细胞接触24 h 和48h后收获细胞。2.6 对照空白对照：即受试物浓度为0的对照。溶剂对照：生理盐水或受试物的溶剂对照。阳性对照：可采用环磷酰胺、丝裂霉素等已知染色体畸试验阳性的化合物。S9mix对照作对照。2.7 镜检：每种浓度至少观察100个中期分裂相，在油镜下观察染色体畸变数和畸变类型。接受试物不同浓度、对照，以及不同作用时间，列表不示。2.8 判定：正常CHL细胞染色体自发畸变率10，具有剂量依赖关系或虽无剂量依赖关系，但某一测试点可重复，均判断为阳性。诱发畸变率5而10为可疑。3啮齿动物微核试验3.1 动物：常选用小鼠，建议首先NIH小鼠，也可用BALB/C或昆明种等其他小鼠。一般每组10只，雌雄各半；或至少每组6只性成熟雄性小鼠。3.2 给受试物途径和方法：给受试物途径尽可能同实际应用一致。一般为单次给受试物，必要时也可多次给受试物。3.3 剂量和分组：至少设三个剂量组，并设阴性和阳性对照组。高剂量组以1/2LD50为准。如无法测量得LD50可以不引起动物死亡的最大浓度下的最大容积，作为最高剂量。中、低剂量组可按高剂量组半量递减。阴性对照组可用深媒或生理盐水。阳性对照组可用已知阳性药物如环磷酰胺。3.4 标本制作：在给受试物后适当时间处死动物（一般在24h后），取骨髓涂片，Giemsa或丫啶橙染色。3.5 镜检：每只动物至少计数1000个嗜多染色红细胞，检查计数其中带微核的细胞数，心表示，经统计判定结果。3.6 判定：符合以下二条之一，即可判定为阳性。3.7 受试物诱发微核率增加，有统计学显著性与剂量相关。3.8 某一测试点微核增加，有可重复性，有统计学意义。4. 小鼠精子畸形试验4.1 动物：成年雄性小鼠，体重2535g。4.2 计量选择和动物分组：设1/2、1/5、1/10和1/20 LD50剂量组以及阳性对照组和阴性对照组。阳性对照组腹腔注射环磷酰胺，剂量为40mg/kg体重。阴性对照组为溶剂对照。4.3 染毒方式：经口灌入受试物，连续5天，每天一次。4.4 实验步骤：a)于染毒后4周用颈椎脱臼的方式处死动物，剖腹，取出附睾。b)将附睾放入盛有2ml生理盐水的小平皿中，用眼科剪刀剪碎。c)以四层擦镜纸过滤，滤液涂片，自然干燥。d)将玻片置甲醇中固定5min，用2.5伊红染色1h，封片。e)在显微镜（4010）下计数2000个精子中畸变的精子数，精子畸形，主要表现在头部，其次为尾部，畸形类型可分为无钩、香蕉形、胖头、无定形、尾折叠、双头、双尾等。异常精子均应记录显微镜的坐标数，以备查询。以便统计精子畸形率及精子畸形类型的构成比。f)判断双头，双尾畸形时，要注意与二条精子的部分重叠相鉴别，判断无定形时要与人为剪碎及折叠相鉴别。4.5 结果评价：每个剂量组应分别与相应的阴性对照组进行参数统计比较，精子畸形阳性的标准是，畸形率至少为阴性对照组的倍量或经统计有显著性意义，并有剂量反应关系（一般阴性对照组的精子异常率为0.83.4）。七、致畸试验1试剂及其配制：（实验用水纯化水）。1.1 甲醛、乙酸、2.4.6-三硝基酚、氢氧化钾、甘油、水合氯醛、茜素红。1.2 茜素红贮备液：茜素红-S，50%乙酸饱和液5.0ml，甘油10.0ml，1%水合氯醛溶液60.0ml混合，放入棕色瓶中。1.3 茜素红应用液：取贮备液35 ml，用12g/100ml氢氧化钾液稀释至1000 ml，存于棕色瓶中。1.4 透明液A：甘油200 ml、氢氧化钾10、纯化水790ml混合。1.5 透明液B：肝油与纯化水等量混合。1.6 固定液：Bouins液：2.4.6-三硝基酚75份、甲醛20份、乙酸5份。2.仪器与设备2.1 实验室常用设备。2.2 生物显微镜及体视显微镜。2.3 游标卡尺（百分尺）。3.实验动物常用实验动物为孕鼠。致畸应选用孕鼠至少60只。4.剂量分组：至少设四个组，一个空白对照组，3个试验组剂量原则上可采用1/4、1/16、1/64LD50，或以亚急性毒性试验最大无作用剂量为高剂量组，其1/30左右为低剂量组，在其间设一组。对某种新的动物，初次试验可设阳性对照组。每组至少12只孕鼠。常用阳性对照物有敌枯双（0.51.0mg/kg体重）五氯酚钠（30 mg /kg体重）、阿斯匹林（250300 mg /kg体重）及维生素A250004000IU等。5.致畸结果判定5.1 孕鼠处死和检查：大鼠于妊娠20d，小鼠第18d，兔第29d处死。大鼠用2d/100ml硫喷妥钠11.5ml/只腹腔注射，麻醉或直接断头。剖腹取出子宫称重，记录并检查胚胎、着床数、早期吸收胎，迟死胎及活胎数。5.2 活胎鼠检查：逐一记录胎仔体重、体长、检查胎鼠外观有无异常，如头部有无脑膨出、露脑、小头、小耳、无眼和睁眼、兔唇、下颌裂、躯干部有无腹壁裂、脐疝、脊柱弯曲，四肢有无小肢、短肢、并趾、无趾等，尾部有无短尾、卷尾、无尾，肛门有无闭锁。5.3 胎鼠骨标本的制作与检查：将每窝1/2的活胎（奇数或偶数）放入95%（V/V）乙醇中固定23周，取出胎仔（或可去皮、去内脏及脂肪）流水冲洗数分钟后放入12g/100ml的氢氧化钾溶液内（至少5倍于胎仔体积）872h，透明后放入茜红素S应用液中染色648h，并轻摇12次/d，至头骨染红为宜。再放入透明液A中的12d，放入透明液B中23d，待骨骼染红而软组织基本褪色，将标本放入小平皿中，用透射光源，在体视显微镜下作整体观察，然后逐步检查骨骼。测量卤门大小、矢状缝的宽度、头顶间骨及后头骨缺损情况，然后检查胸骨的数目，缺失或融合（胸骨为6个，骨化不全时首先缺第5胸骨、次为缺第2胸骨）。肋骨通常1213对，常见畸形有融合肋、分叉肋、波状肋、短肋、多肋、缺肋、肋骨中断。脊柱发育和椎体数目（颈椎7个，胸椎1213个，腰椎56个，底椎4个，尾椎35个）有无融合、纵裂等。最后检查四肢骨。5.4 胎鼠内脏检查：每窝的1/2胎鼠放入Bouins液中，固定两周后作内脏检查。先用自来水冲去固定液，将鼠仰放在石蜡板上，剪去四肢和尾，用好刀片从头部到尾部逐段横切或纵切。按不同部位的断面观察器官的大小、形状和相对位置。a) 经口从舌与两口角向枕部横切，可观察大脑、间脑、正脑、舌及鄂裂。b) 在眼前面作垂直纵切、可见鼻部。c) 从头部垂直通过眼球中央作纵切。d) 沿头部最大横位处穿过脑作切面。以上切面的目的可观察舌裂、鄂裂、眼球畸形、脑和脑室异常。e) 沿小鄂水平通过颈部作横切面，可观察气管、食管和延脑或脊髓。以后自腹中线剪开胸、腹腔，依次检查心、肺、横隔膜、肝、胃肠等脏器的大小、位置，查毕将其摘除，再检查肾脏、输尿管、膀胱、子宫或睾丸位置及发育情况。然后将肾脏切开，观察有无肾盂积水与扩大。6统计方法及结果评定各种率的检查用X2检验，孕鼠增重用方差分析或非参数统计，胎鼠身长、体重、窝平均活胎数T检验。结果应能得到受试物是否有母体毒性和胚胎毒性、致畸性，最好能得出最小畸剂量。为比较不同有害物质的致畸强度，可计算致畸指数，暂以致畸指数10以下为不致畸，10100为致畸，100以下为强致畸。为表示有害物质在保健用品中存在时人体受害机率，可计算致畸危害指数，如指数大于300说明该物质对人危害小，100300为中等，小于100为大。八、致癌试验1 .致癌试验的预试验：经致突变试验阳性者，应进行本试验。大鼠和小鼠对致癌物质较敏感，自然寿命比较适当，故较为常用。预备试验的目的是确定致癌试验的最高剂量。致癌试验是最高剂量应是经过三个月的亚急性毒性试验中毒死亡，其体重增长不低于对照组10%，机体一般状况和实验检查变化不大的剂量。如果经过急性毒性和长期毒性试验，有足够的实验数据可以确定这一剂量度；或毒性很小，长期毒性试验未发现任何毒性反应时，这一阶段的试验可以免作。1.1动物：与正式试验不同，最好用两种动物。1.2 剂量和分组：设三个以上剂量组，另设对照组啮齿类动物，每组雌雄各10只。最高剂量应高于中毒阈剂量，即应出现某些毒性症状。低剂量组则不应出现毒性症状，体重增长不应低于对照组10%。1.3 给受试物周期：连续给受试物90天。1.4 受试物和给受试物途径：口服宜用掺饲法，将受试物均匀混入饲料或饮水中给予。饲料内，受试物含量也不宜超过10%，以免影响动物的正常营养。1.5 观察与检查：每天观察动物一般状况，每周一次测量动物体重。对死亡动物及试验期末动物，均需剖检并作病理剖记录，肉眼观察认为有病变，或可疑病变的脏器，应进行病理组织