临床医学工程实践实验报告.doc

临床医学工程实践实验报告实验一 制备试剂配方1、 实验目的通过本次实验，掌握10TBE Buffer、PBS Buffer、1 M Tris-HCl、10%（W/V）SDS、5 M NaCl、0.5 M EDTA、CTAB/NaCl溶液的配置方法和技术，为后续实验做准备。2、 实验仪器仪器名称规格型号玻璃棒胶头滴管药匙酸碱试纸SL302型电子天平30g/0.01g 00455京制00000249号电子天平e=10dTop Pette Single Channel Pipettor2-20ul、20-200ul、100-1000ul数显式电热恒温水浴锅HH.S21-8纯水仪Aquelix5烧杯50ml、100ml、200ml、500ml立式压力蒸汽灭菌器YXQ-LS-50SII实验试剂Tris硼酸NaClKCl浓盐酸SDSNaOHCATB3、 试剂配方及操作步骤试剂组分溶度配置量配制方法10TBE Buffer890 mM Tris-硼酸、20 mM EDTA200ml1、 称量Tris 21.6g、 1.488g、硼酸11g置于烧杯中；2、向烧杯中加入约160ml的去离子水，充分搅拌溶解；3、加去离子水将溶液定容至200ml后，室温保存PBS Buffer(pH7.4)137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM 、2 mM 200ml1、称量NaCl 1.6g、KCl 0.04g、 0.284g、 0.054g，置于烧杯中；2、向烧杯中加入约160ml的去离子水，充分搅拌溶解；3、滴加浓盐酸将pH值调节至7.4，然后加去离子水将溶液定容至200ml；4、高温高压灭菌后，室温保存1 M Tris-HCl（pH 8.0）1 M Tris-HCl200ml1、称量24.22g Tris置于烧杯中；2、加入约160ml的去离子水，充分搅拌溶解；3、加入约8.4ml浓盐酸将溶液调节至pH 8.0；4、将溶液定容至200ml；5、高温高压灭菌后，室温保存10%（W/V）SDS10%（W/V）SDS50ml1、称量5g高纯度的SDS置于烧杯中，加入约40ml的去离子水，68加热溶解；2、将溶液定容至50ml5 M NaCl5 M NaCl200ml1、称取58.44g NaCl置于烧杯中，加入约160ml的去离子水，搅拌溶解；2、加去离子水将溶液定容至200ml；3、高温高压灭菌后，4保存0.5 M EDTA（pH8.0）0.5 M EDTA50ml1、 称取 9.305g置于烧杯中；2、加入约40ml的去离子水，搅拌溶解；3、用NaOH调节pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解；4、加去离子水将溶液定容至50ml；5、高温高压灭菌6、室温保存CTAB/NaCl溶液2%CATB50ml1、称取CATB 1g，NaCl 4.085g，置于烧杯中；2、加入约5ml 1M Tris-HCl（pH8.0）;3、加入约2ml 0.5M EDTA；4、加入17.5ml ，再定容至50ml，高温高压灭菌；5、常温保存注意事项：1. 配制溶液时，注意在溶液容器上贴上标签，标签内容包括溶液名称、体积、pH等等；2. 在完成配置溶液后，将PBS Buffer(pH7.4)、1 M Tris-HCl（pH 8.0）、5 M NaCl、0.5 M EDTA（pH8.0）、CTAB/NaCl溶液置于立式压力蒸汽灭菌器中高温高压灭菌。4、 实验分析1、 遇到问题及解决（1）在配置10TBE Buffer时，将Tris与Tris盐酸盐搞混，错将Tris盐酸盐拿来配置；在问题及时发现后，我们重新用Tris配置了10TBE Buffer。（2）在配置PBS Buffer(pH7.4)时，由于称量误差，PBS Buffer溶液偏酸，已经无法通过浓盐酸滴定到指定pH7.4，我们通过NaOH将pH调节到7.4。2、 实验误差（1） 仪器本身的系统误差；（2） 读数造成的误差，溶液溶度有区别。3、 实验心得本次的实验我有如下几点心得：其一，我们组是与第四小组合作，我们小组配置10TBE Buffer、PBS Buffer、1 M Tris-HCl、10%（W/V）SDS，第四小组配置5 M NaCl、0.5 M EDTA、CTAB/NaCl溶液，每样溶液各配置两份，通过两组合作减少实验时间，提高实验效率；其二，通过这次实验我简单掌握了生物实验最基础的准备步骤实验溶液的配比，也简单掌握了基础实验仪器的操作，这一点为我们进一步学习生物医学工程奠定了基础，是我们以后想在生物行业有所发展必经的入门途径；其三，通过这次实验，发现问题并解决问题，这一点不管是在以后生物实验方面还是在其他工作方面都能很好的锻炼我们。实验二 细胞传代培养和基因组DNA提取【细胞传代培养】1、 实验目的了解贴壁细胞传代和换液的意义；掌握贴壁细胞换液和传代基本方法。2、 实验仪器及试剂仪器名称规格型号冰箱（4）废液缸倒置相差显微镜枪头冻存管2ml超净工作台JB-CJ-1FD高速离心机Neofuge15R细胞培养箱HF-90Top Pette Single Channel Pipettor100-1000ul纯水仪Aquelix5培养瓶25ml立式压力蒸汽灭菌器YXQ-LS-50SII实验试剂10%胎牛血清培养基0.25%胰酶HANKS液甘油3、 实验过程1、 细胞传代1) 用酒精擦拭超净工作台，点燃酒精灯2) 弃旧培养液：倒掉原瓶中的旧培养基3) 加入2mLHANKS液，漂洗贴壁细胞一次后倒掉4) 在瓶中加入0.25%胰蛋白酶0.5ml，轻轻摇动培养瓶，经胰酶液体铺满所有细胞表面，在倒置显微镜下观察细胞，待1/2以上的细胞变圆后倒掉胰酶终止消化5) 加入10%胎牛血清培养基3ml，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，使细胞脱落到培养基中6) 用移液枪取出1.5ml细胞液加入到一个新的25ml培养瓶中，再在两个25ml培养瓶中各加10%胎牛血清培养基1.5ml，使每个培养瓶中的细胞液为3ml7) 给新的25ml培养瓶贴上“传代后”标签，将两个培养瓶放到细胞培养箱中培养。2、 细胞换液1) 用酒精擦拭超净工作台，点燃酒精灯2) 倒掉原瓶和传代后瓶中的旧培养基3) 分别用移液枪吸取10%胎牛血清培养基3ml到原培养瓶和传代后培养瓶中4) 将两瓶细胞放到倒置显微镜下观察，并用电脑拍照5) 将两瓶细胞放到细胞培养箱中继续培养3、 细胞冻存1) 用酒精擦拭超净工作台，点燃酒精灯2) 倒掉原瓶和传代后瓶中的旧培养基3) 将两个培养瓶拿到倒置显微镜下观察并拍照4) 分别在两瓶中加入0.25%胰蛋白酶0.5ml，轻轻摇动培养瓶，经胰酶液体铺满所有细胞表面，在倒置显微镜下观察细胞，待1/2以上的细胞变圆后倒掉胰酶终止消化5) 各加入10%胎牛血清培养基3ml，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，使细胞脱落到培养基中6) 用移液枪在两个培养瓶中各取出细胞液0.8ml加入到2个冻存管中，再在两个2ml冻存管中各加入甘油0.2ml，密封好两个冻存管。注意事项：1、 细胞传代再加胰蛋白酶时，或细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，再继续作用23分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的消化液呈片状从瓶壁上脱落下来，在显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化）。在37或25以上环境进行消化。 2、 细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSP和90-95%原来的细胞生长用之新鲜培养基均匀混合。注意由于DMSO稀释时会释放出大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。4、 实验结果1、 细胞传代（三张照片分别是在不同的培养瓶位置照摄而得）2、 细胞换液 （这两张照片是在换液前拍摄的） （这两张照片是在换液后拍摄而得）3、 细胞冻存 （细胞冻存前） （细胞冻存后）5、 实验分析1、 遇到问题及解决1) 在细胞培养的实验中，细胞的标签掉了，因为又没有记细胞的名称，所以不知道是什么细胞，不能冻存。2) 细胞拍摄环节，由于对于倒置显微镜操作比较陌生，调节合适光亮、位置及粗调细调遇到了困难，我们请教了其他小组熟悉倒置显微镜操作的同学，让他帮我们调节到合适观察的情况。2、 实验心得在这个实验中我们把细胞的标签弄丢了，这个是很大的失误，吃一堑长一智，这个教训让我们以后绕绕记住了对于细胞上的信息要再三的确认，细胞的种类要写清楚，并且在实验笔记上也应该清楚的记着，以防出现类似的失误。通过这个实验，我们初步学习了细胞传代培养的步骤及操作，因为我们组有曾经参加省生物竞赛的同学，对细胞传代培养进行多次操作过，因此，这个实验我们组也较快的完成并掌握了。【细胞基因组DNA提取】1、 实验目的1、 掌握细胞基因组DNA提取的原理和方法；2、 学会对实验现象进行分析。2、 实验仪器及试剂仪器名称规格型号微型离心机WH-866旋涡混合器冰箱离心管1.5ml高速离心机Neofuge15RTop Pette Single Channel Pipettor2-20ul、20-200ul、100-1000ul数显式电热恒温水浴锅HH.S21-8纯水仪Aquelix5烧杯50ml、100ml实验试剂PBS Buffer(pH7.4)10mmol/L Tris-Cl0.1mol/L EDTA0.5%SDS蛋白酶K（Protease K 20mg/mL） 5M NaClCTAB/NaCl溶液氯仿/异戊醇（24:1）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）异丙醇无水乙醇TE缓冲液DNA提取缓冲液：10mmol/L Tris-Cl，0.1mol/L EDTA，0.5%SDS3、 实验过程1、细胞用微型离心机离心收集，速率为3000rpm，时间为5min，冷冻保存；2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗，离心去上清，重复2次；3、加入500ulDNA提取缓冲液混匀；4、加入10ul蛋白酶K使终浓度达到50ug/ml 混匀，50水浴3h；5、加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65温育10min。5、加入等体积（约600 L）氯仿/异戊醇（24:1），充分混匀，10,000 rpm离心5 min。 离心后，转移含有核酸的上清液（水相，即上清液A）至新的1.5 mL离心管中。6、加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）于上清液A中，充分混匀，10000 rpm离心5 min。离心后，转移含有核酸的上清液（水相，即上清液B）至新的1.5mL离心管中。7、加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）于上清液B中，充分混匀，10,000 rpm离心5 min。离心后，转移含有核酸的上清液（水相，即上清液C）至新的1.5 mL离心管中。8、加入0.7倍体积的异丙醇至上清液C以沉淀DNA，上下轻柔颠倒离心管几次，可见白色、黏样沉淀即为DNA。常温静置560 min后，12,00015,000 rpm常温离心15-30 min。可见DNA团集于离心管壁边上。然后小心去除异丙醇，避免碰到DNA团。9、加入2倍体积-20预冷无水乙醇，常温 12,00015,000 rpm离心1530 min。小心除去乙醇。10、室温敞口放置10min后，然后加入20L TE缓冲液重悬DNA，可放置37下使DNA重悬完全。注意事项：1、 标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整，所用EP管、吸嘴等器物及ddH2O、试剂等应先进行高温高压灭菌；2、 吸收酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）应注意将移液管往下一点去吸取，因为酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）分为上下两层，上层为水；3、 混合试剂、吸取上清等操作时应尽量避免动作剧烈；4、 弃异丙醇时动作应该要轻，切记甩干，以免DNA丢失4、 实验分析1、 遇到问题及解决（1） DNA提取缓冲液配置时，各成分含量计算遇到困难，经过老师讲解之后，对各成分的计算有个清晰的理解，可以通过计算各各成分在缓冲液中的溶质含量，在计算在原溶液中的体积含量，得出我们各各成分需要多少；（2） 吸取酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）之前，未对它有个清晰的了解，不知道酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）上下分层，吸取的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）一部分是水，一部分是酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）；（3） 加2倍体积-20预冷无水乙醇，不了解无水乙醇的作用，不知道该加入多少无水乙醇。用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67左右。因而也可改用95乙醇来替代无水乙醇。最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。 一般在室温下放置1530分钟即可。2、 实验心得通过这次实验的操作，我了解到了我们做实验的时候都欠缺思考，没有去认真的了解实验各个试剂各自的作用，没有独立的去思考问题该怎么解决，为什么这么做，而是遇到问题就去询问老师。这一点值得我们以后去改进。通过这次实验，我也了解了细胞基因组DNA提取的方法，这个实践是我们的生物实验经验的充实，对我们以后去一些生物公司工作是我们相对于其他人的一个优势。实验三 聚合酶链式反应（PCR）1、 实验目的掌握PCR扩增技术的原理；掌握PCR体系建立的操作。2、 实验仪器及试剂仪器名称规格型号微型离心机冰箱离心管0.2mlEppendonf AG200-240V、700W、50-60Hz实验试剂DNA模版 (基因组)对应目的基因的特异引物10PCR Buffer 2mM dNTPmixTaq聚合酶 2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM；备注：在实验进行之前，先准备一些小冰块，因为实验要在冰浴中进行。3、 实验过程1、在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.2ml离心管中。10PCR buffer 2.0 ldNTP mix （2mM） 4.0 l引物1（10pM） 2.5 l引物2（10pM） 2.5 lDNA模板（50ng-1g/l） 2.0 l加ddH2O至 20 lTaq酶 （2U/l） 0.3 l2、 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在95预变性5min，进入循环扩增阶段：94 40s 58 30s 72 60s，循环35次，最后在72 保温10min，4保温。3、 结束反应，PCR产物放置于冰箱-20长期保存。注意事项：1、PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。、纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。、所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。、PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22m滤膜过滤除菌或高压灭菌。 、试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。、试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。、PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。4、 实验分析1、 遇到问题及解决（1）在依次将所有的试剂加完之后，我们加了很多去离子水，所以导致200ul的离心管中液体太多，DNA不能扩增。我们在之后电泳实验时，向其他小组的同学借了他们的DNA模板，重新进行PCR扩增；（2）原先的DNA模板用完之后，以为不要了，顺手加了很多去离子水，所以也不能用了，跟上述一样，我们在之后电泳实验时向其他小组的同学借了DNA模板。2、 实验心得每次的实验操作都应该要小心细致，在PCR扩增实验这一步我们的实验基本上算是失败的，在做实验的时候，我们需要了解实验的注意事项，以防止实验过程中任何一个步骤出错，导致整个实验的失败。每个生物实验都应该认真的对待，每个步骤只要有一点小失误，随时可能导致之后实验的失败。这也告诉我们，进行生物实验需要我们不断地积累经验，在发现问题中解决问题，积累经验能够使我们得到不单只一个的解决方案，在不同实验条件下，我们需要用我们仅有的实验器材对我们的失误进行解决。然后通过这个活动，我们也了解到了同学间相互帮助相互合作，不管在这次实验还是以后的生活中都是一个大的收获。实验四 琼脂糖凝胶电泳1、 实验目的学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测基因组模板和PCR产物的方法和技术，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、含量以及分子量、及分离不同大小的DNA片段。2、 实验仪器及试剂仪器名称规格型号药匙凝胶成像系统Top Pette Single Channel Pipettor(微型)0.1-10ul格兰仕微波炉P70017TL-D5纯水仪Aquelix5跑胶TanonEPS 300锥形瓶100mlSL302N型电子天平300g/0.01g 00455实验试剂琼脂糖10TBE BufferDNA样品6Loading buffer溴化乙锭1TAE Marker 150bp3、 实验流程1、 稀释：将10TBE Buffer稀释为0.5TBE Buffer；2、制备1%琼脂糖凝胶(50ml)：称取0.5 g琼脂糖置于锥形瓶中，加入50ml 0.5TBE。微波炉加热，至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液；3、 胶板制备：取制胶槽洗干净，晾干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到65左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加0.5TBE电泳缓冲液至没过胶板1-2mm为止； 4、 加样：在点样板上DNA样品和PCR产物分别与6loading buffer混合，DNA样品（或者PCR产物）和6loading buffer的添加比例是5：1，将6loading buffer稀释6倍；DNA样品 5ul+6loading buffer 1ulPCR产物 10ul+6loading buffer 2ul在点样板上其中一孔用移液枪加marker 3-5ul；5、 电泳：加样后的凝胶板通电电泳，电压100V，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。当溴酚蓝移动到距离胶板三分之二处时，停止电泳；一般电泳时间为3045min；6、 染色：电泳完毕后，取出凝胶，用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1TAE溶液染色约30 min；7、 观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。注意事项：1、 在制备1%琼脂糖凝胶微波炉加热时，尽量每30s将装有琼脂糖的锥形瓶拿出摇匀，再在微波炉加热，如此循环，直至琼脂糖溶解；2、 制备1%琼脂糖凝胶前先用记号笔标记溶液顶部水平高度，在完成微波炉加热后，将溶液用去离子水定容至标记的位置，因为琼脂糖溶液在加热时会存在部分挥发，3