紫外可见吸光光度法及分子荧光分析法.ppt

1,二战期间，美国政府希望士兵得到较好的营养。但是当时，不知道食品中到底有什么维生素，有多少。在当时需要简便快速的测定方法。 1941年，第一台commercial available 的分光光度计问世。 Beckman DU Spectrophotometer.使得维生素的测定变得非常简单。,2,Water Analytical Chemistry,第八章 吸光光谱法,8.1 吸光光谱 8.2 比色法和分光光度法 8.3 显色反应及其影响因素 8.4 吸收光谱法定量的基本方法 8.5 应用实例,3,吸收光谱法：基于被测物质的分子（或原子） 对光 具有选择吸收的特性而建立的分析方法。,基本概念,分光光度法：光强为I0的单色光照射到样品上，样品中被测组分吸收部分光，透射光强减弱为 It 。通过测量光强度的变化来得出被测物质量,4,物质为何对光有选择性的吸收？ 光强度的减弱如何与物质的浓度联系起来？I =f(c) 怎样测量光的减弱(I ) ？ 如何获得单色光？,思 考,5,1 电磁波谱 2 物质对光的吸收 3 溶液的吸光定律 4 郎伯-比尔定律适用范围,8.1 吸光光谱,6,1 电磁波谱,10nm200nm,200nm 380nm,380nm 780nm,780 nm 2.5 m,2.5 m 50 m,50 m 300 m,7,单一波长的光,由不同波长的光组合而成的光,若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光,2 物质对光的吸收物质的颜色与光的关系,完全吸收,完全透过,各种光部分 均匀被吸收,光谱示意,表观现象示意,复合光,玻璃在可见光区是透明的；石英在紫外光区是透明的,物体选择性吸收某种光,物体呈现其互补光颜色,9,物质的颜色与吸收光、透过光的关系,物质呈现透过光的颜色，被吸收的光与透过光呈互补色,KMnO4,10,一定波长（频率）的光具有一定的能量 E=hv=hc/ ,3 物质对光选择吸收,11,物质对光选择吸收的实质：物质原子或分子的核外电子能级不同，只能吸收能量与其能级差相匹配的波长的光。,原子对光的吸收,物质对光的吸收满足条件：,12,吸收光谱 Absorption Spectrum,原子纯电子能态 间跃迁,分子核外电子跃迁,带状光谱,锐线光谱,吸光度,紫外-可见光区产生吸收的分子结构中必须有共轭键或杂原子（生色团和助色团）,14,最大吸收波长max：最大吸收峰对应的波长,Cr2O72-、MnO4-的特征吸收光谱,15,吸收光谱法定性分析与定量分析的基础,定性分析基础,定量分析基础,物质对光的选择吸收,在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。,16,4 溶液的吸光定律,透光率 （透射比）Transmittance,透光率定义：,T 取值为0.0 % 100.0 %,全部吸收,T = 0.0 %,全部透射,T = 100.0 %,17,Lambert Beer 光吸收定律：当一束平行单色光通过均匀的样品时，其吸光度与吸光组分的浓度、吸收池的厚度乘积成正比.,如何测定吸光度（光强）？,C,思考：如何获得单色光？单色光的波长如何选择？,或,18,吸光度（Absorbance）与透光率的关系,T ： 透光率,A： 吸光度,T,T = 0.0 %,A = ,T = 100.0 %,A = 0.0,A = 0.434,T = 36.8 %,吸光度适宜的取值范围：0.20.8,19,吸光系数,L ：吸光液层的厚度，光程， cm,C：吸光物质的浓度， g / L, mol / L, ：比例常数,入射光波长,物质的性质,温度,取值与浓度的单位相关,c：mol / L,摩尔吸收系数， L mol 1 cm -1,c：g / L,质量吸收系数， L g 1 cm -1,相互关系：,M为摩尔质量, 越大, 灵敏度越高: 105为高灵敏度.,20,双硫腙法测定Pb2+，浓度为0.080mg/50ml 的Pb2+溶液，用2cm的比色皿于520nm处测得吸光度=0.28。求摩尔吸收系数。,例：,Pb2+= 0.080 x 10-3 / 50 x 10-3 x 207,= 7.7 x 10-6mol /L,520= A / LC=0.28 / 2x7.7x10-6,= 1.8x104 L /（mol.cm）,吸光系数可查表或实测得到,21,吸光度的加合性,多组分体系中，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具有加合性，即,A = A1 + A2 + +An,22,有机物综合指标紫外吸光度(Ultraviolet Absorbance UVA),含不饱和键和杂原子的有机物在紫外光254nm初的吸光度之和,23,朗伯比尔定律的局限性 定律本身的局限性： 只适于稀溶液0.01mol/L 高浓度时组分间有相互作用：分子间距减小、相邻粒子的电荷分布变化等引起的变化 化学偏离：被分析物质与溶剂发生缔合、离解、溶剂化反应，产生不同的吸收光谱 仪器偏离：单色光不纯引起,5 郎伯-比尔定律的适用范围,吸收定律偏离,郎比定律适用前提是对单色光的吸收，而实际上波长选择器从连续光源中分离出的是所需波长的波长带（多色辐射）,24,朗伯-比尔定律的适用条件,1. 单色光：应选用max处或肩峰处测定，此时干扰组分、溶剂等不吸收或有很弱的吸收,3. 稀溶液 浓度增大，分子之间作用增强,2. 吸光质点形式不变 离解、络合、缔合会破坏线性关系, 应控制条件(酸度、浓度、介质等).,25,溶液浓度的测定,A CL,工作曲线法 (校准曲线),朗伯-比尔定律在定量分析中的应用,0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL),A,。 。 。 。,*,0.80 0.60 0.40 0.20 0.00,Ax,cx,26,吸光度的测量,除被测组分对波长为的光有吸收外，还有其他干扰吸收： 1）吸收池对光的反射、吸收； 2）样品中样品基体、显色剂(或其它试剂）和共存组分对光的吸收,消除措施：用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。,27,参比溶液的选择,溶剂空白:纯溶剂（扣除吸收池干扰）适用于样品基体、共存组分和显色剂均无色情况,试剂空白:纯溶剂+显色剂+其他试剂,适用于样品基体、共存组分无色，显色剂等均有色,样品空白:待测试样溶液,适用于显色剂无色，共存组分、样品基体有色,空白溶液:显色剂 + 待测试样 + 待测组分的掩蔽剂，适用于显色剂、样品基体、共存组分均有色,28,8. 2 比色法和分光光度法,1 比色法,目视比色法 光电比色法,2 分光光度法,3 分光光度计的校正,4 722型分光光度计,29,比色法和分光光度法特点 灵敏度高：测定下限可达10-310-6 molL-1, 10-4%10-5% 准确度能够满足微量组分的测定要求：相对误差25 操作简便快速 应用广泛,30,1）目视比色法,特点,利用眼睛比较被测样品与标准系列颜色的深浅,利用复合光（太阳光）测量的是透过光的强度,准确度低,用于限界分析,不可分辨多组分,方法简便，灵敏度高,31,2） 光电比色法,光电比色计结构示意图,通过滤光片分出一窄范围的光(几十nm，近似单色光)，照射样品池，测量的是吸收光的强度,吸收滤光片：只允许指定的窄范围波长光透过，其他波长的光均被吸收,光电比色法的局限性： （1）预先知道吸收波长 （2）单色光不纯 （3）只限于可见光,32,光源,单色器,吸收池,检测器,显示,2 分光光度法,特点：（1）可连续分出纯度较高的单色光 （2）精确，可选择最大吸收波长 （3）应用范围可扩展到紫外光和红外光区，对应称为紫外分光光度计、红外分光光度计 （4）可进行多组分的测定,33,单波长单光束分光光度计：一束单色光轮流通过参比和试样溶液，由于电源波动引起的误差较大简易型分光光度计,分光光度计的类型,34,单波长双光束分光光度计,35,双波长分光光度计,Y 的存在不干扰 X 的测定,36,分光光度计组件,光源,单色器,样品池,检测器,信号输出,氢灯，氘灯，185 350 nm； 卤钨灯，250 2000 nm.,基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定,（又称比色皿）玻璃，光学玻璃，石英，按其厚度分为0.5 cm，l cm，2 cm，3 cm和5 cm。,作用：将光信号转换为电信号，并放大,光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄像管（多道分析器）,表头、记录仪、屏幕、数字显示,作用：将复合光色散成单色光,37,38,单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。,棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同 玻璃3503200nm, 石英1854000 nm,39,光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。 利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。,波长范围宽, 色散均匀, 分辨性能好, 使用方便.,平面透射光栅 反射光栅,40,样品池：用于盛放分析试样（对液体试液） 要求：能透过有关辐射线，为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。 紫外光区：石英吸收池 可见光区：石英或玻璃吸收池 测定注意事项： 参照池和吸收池应是一对经校正好的匹配吸收池。因为吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。 使用前后都应将吸收池洗净，不能用手接触窗口（光面） 已匹配好的吸收池不能用炉子或火焰干燥,41,光电倍增管(Photomultiplier Tube, PMT),1个光子可产生106107个电子,160-700 nm,42,不同光区的吸光光度法仪器主要差异比较,1、波长校正：利用光源中的稳定线光谱或有稳定亮线的外部光源，把光束导入光路进行校正。如氘灯的486.02和656.10nm谱线进行校正。 或者测定已知光谱样品的光谱，与标准光谱对照进行校正，如谱钕滤光片。一些紫外-可见光分光光度计具有自动校正程序。 2、吸光度校正:一般常用碱性重铬酸钾标准溶液进行吸光度校正，测定的数值与标准吸光度表比较。 3、比色皿校正：,3 分光光度计的校正,比色皿有方向性：有些比色皿上印有方向标志，使用时必须注意。校正无方向标志的比色皿时，要先确定方向并作好标志，以减少测定误差。 同一组比色皿相互间的差异应小于测定误差。测定同一溶液时，同组比色皿之间吸光度相差应小于0.005 校正比色皿的光吸收误差时，应将纯净的蒸馏水注入皿中，以其中吸收最小的比色皿的吸光度为零，测定其它比色皿的吸光度。测定比色液时，应将其吸光度减去比色皿的吸光度（平均值） 校正比色皿光程长度误差时，可将吸光度约为0.4的溶液注入皿中，测定其吸光度，以具有准确光程长度的比色皿的吸光度与之比较，以标准比色皿的吸光度为基准，分别求出其与各待校正比色皿的吸光度测定值的比值。测定比色液时，可将所测得的吸光度乘以各该比值,比色皿的校正,45,4 722型可见光分光光度计,光源：钨卤素灯12V、30W 波长范围：330800nm 分光元件：光栅，1200线/mm 检测器：端窗式G1030光电管 多碱阴极真空管 3008