细胞工程的理论基础.ppt

第二章 细胞工程的理论基础,山东师范大学生命科学学院,动物细胞与组织培养（cell and tissue culture）是动物细胞工程的重要技术基础。 动物的细胞与组织培养是指从活的机体中取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术。,组织培养的概念 组织培养这一名词实际上是一个通用名词，习惯上泛指所有的体外培养。根据培养物的不同可概括为三个不同概念：细胞培养、组织培养和器官培养。,A：细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。,B：组织培养：将活体的一小片组织放在盛有培养液的玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面移动生长的过程称为组织培养。 从组织块中生长出来的仍然是细胞，细胞在生长的同时也发生移动，至使组织培养难以长时间维持其原有结构，结果也就成了细胞培养。,C：器官培养：是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外存活、生长，并保持其原有结构和功能的培养技术。,体外培养的种类,二、 细胞培养的现实意义,生物技术上：生产各种生技术产品如：狂犬病、小儿麻痹 症等病毒疫苗，表皮生长因子及干扰素、白 细胞介素等生长因子及单克隆抗体等。 科学研究上：在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等方面。 临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾 病的治疗等,三、细胞培养的优点,1.研究的对象是活细胞 在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。,2. 研究条件可以人为控制 可以根据需要，控制包括pH、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理化学的条件，同时，可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。,3. 研究的样本可以达到比较均一性 通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。,4. 研究内容便于观察、检测和记录 采用各种研究技术、记录方法： 研究: 倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流 式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原 位杂交、同位素标记- 记录: 摄影照片、缩时电影、电视-,5.研究的范围比较广泛 学科多： 细胞学、免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、分子生物学等 对象广： 各种动物：低等动物-高等动物-人类 一种动物：不同年龄- 不同组织- 正常或异常（肿瘤-）,6.研究的费用相对较经济 可提供大量、同一时期、重复性好的、生物学性状相似的实验对象,四、细胞培养的缺点,现人工模拟体内环境的技术已经很高, 但, 人工所模拟的条件与体内实际情况 仍不完全相同. 当细胞被置于体外培养后, 生活在缺乏动态平衡的环境中, 久了，必然发生变化.,因此，对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能又具有某些改变的特定的细胞群体，而不能将之与体内的细胞完全等同。,五、细胞培养的工作原则,有标准化的工作方法 培养用的液体极多（如培养液、胰蛋白酶、HANKS液及 抗菌素等），应由专人负责，并保证做到按规程行事，配制浓度准确，灭菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否和制备日期等。 一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已消毒品与未消毒品应分别存放。,第二节 组织培养的细胞生物学,一、体内外细胞的差异和分化,（一）体内外细胞的差异 培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不显，出现类似“反祖” 现象；表现为细胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。,1.与体内主要不同 相对孤立、相对单一 缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节 和细胞相互间的影响,2.主要表现 失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显 细胞趋向单一化； 3.提示 要正确认识体外培养细胞 是一种特定条件下生长的细胞群体。,二、培养细胞形态分类,体外细胞培养物的生长类型,按生长方式:2型 粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。 绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。,贴附(粘附)型细胞,粘附:是大多数有机体细胞在体内 生存和生长发育的基本存在方式 含义 两方面 结果 基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织， 有机体的绝大多数细胞必须 粘附于一固相表面 才能生存和生长。,培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞。 粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能生存的细胞,类型 细胞在体内、外的粘附方式：存在差异 体内：粘附是全方位 外形具有复杂的立体特征 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 外形一般与体内时明显不同 按照培养细胞粘附生长时的主要形态，可分为几大类型,分类 根据形态大致的不同，主要2类： 上皮细胞型 成纤维细胞型 其它，不定型,上皮细胞型,名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于- 来源：来源于外胚层，内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞 扁平，不规则多角形，中有圆形核,生长特点 易相连成片 相靠紧密相连成薄层 铺石状 生长时呈膜状移动 很少脱离细胞群而单个活动,体外培养细胞类型（1）上皮细胞型,成纤维细胞型,名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮 形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出23个长短不等的突起 中有卵圆形核,生长特点 排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞细胞接触易断开而 单独行动 游离的单独的成纤维样细胞， 常有几个伸长的细胞突起,体外培养细胞类型（2）成纤维细胞型,贴附生长型-类型,1. 与体内同名的细胞不完全相同 如：形态相似的成纤维细胞，可不同来源 自同一动物不同组织的成纤维样细胞相似但 发展趋向不同 2. 培养细胞的形态不稳定 条件改变，细胞形态可有变化,培养细胞形态不稳定 血清 Hela 高血清 低血清 成纤维细胞样 上皮样细胞 pH Hela 太酸或太碱 标准pH 成纤维细胞样 上皮样细胞 细胞密度 3T3 低密度 高密度 成纤维细胞样 上皮样细胞 生长状态改变 悬浮或贴附 悬浮 贴附 圆形 成纤维或上皮样 转化与否 未转化 转化后 成纤维样 可成上皮样,悬浮生长型,概念 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来源 自血，脾或骨髓， 尤以血中白细胞 癌肿细胞也可能 特点 在悬浮中生长良好 细胞圆形，单个或小细胞团,优点 生存空间大，提供数量大 传代方便(不需消化) 易于收获 可获得稳定状态 缺点 观察不方便 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞),三、培养细胞的生长特点,（一）贴附,（二）接触抑制,（三）密度抑制,四、培养细胞的生长和增殖过程,（一）组织培养细胞生命期(Life Span of Culture Cells),所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长 的时间。包括原代培养期、传代培养期及衰退期。,正常培养的细胞周期,原代培养(Primary Culture)期,也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一 次传代阶段，一般持续1-4周。,特点：细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。与 体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。,传代期,特点：在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺 盛，并能维持二倍体核型。,传代：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。,衰退期 特点：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖， 最后衰退凋亡。,（二）体外培养细胞一代生存期,潜伏期 指数增生期 停滞期,所谓细胞的“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。,（三）单个细胞的生长过程,五、体外培养细胞的遗传学特征,（一）核型变化,（二）永生化和恶变,（三）细胞性别,六、体外培养细胞的生存环境,（一）无污染环境,（二）温度,（三）气体环境和氢离子浓度,七、体外培养细胞生存所需基本物质,（一）糖,（二）氨基酸,（三）维生素,（四）促生长因子,（五）其它物质,第三节 建立细胞系或细胞株,一、体外培养细胞的种类和命名,（一）初代培养 初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、 组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代 培养(5ubculture)的细胞，便不再称为初代培养，而改 称为细胞系。,（二）细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。,有限细胞系 无限细胞系,(三)克隆细胞株 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养 或通过筛选购方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细 胞株。,(四)二倍体细胞 培养细胞染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数 相同或基本相同(2n细胞占75或80以上)的细胞群， 称二倍体细胞培养。二倍体细胞在正常情况下具有限 生命期，故属有限细胞系。,(五)肿瘤细胞系或株,是现有细胞系中最多的一类，我国已建立细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈上皮细胞型，常已传几十代或百代以上，并并具有不死性和异体接种致瘤性。,对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解，今列举以下几种代表性的细胞名称供参考； HeLa：为供体患者的性名(来源于宫颈癌) CHO：中国地鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary) 宫743：富颈癌上皮细胞，1974年3月建立 NIH3T3；美国国立卫生研究所(National Institute of Health)建立, 每3天传代一次，每次接种3106细胞毫升。,（六）细胞系或细胞株的命名,二、建立细胞系（或株）的要求,（一）组织来源 （二）细胞生物学检测 （三）培养条件和方法,三、已建立细胞系或株的签定、管理和使用,培 养 简 历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、 供体正常或异常健康状态、细胞已