课件：荧光原位杂技技术及其临床应用李宇中.ppt

荧光原位杂交技术及其临床应用,荧光原位杂交（FISH） 将分子带进细胞遗传学的领域,荧光原位杂交技术,90 年代以后, 随着分子生物学技术的提高以及向各学科的渗透, 出现了一种新的运用分子手段分析染色体异常的方法, 即: 染色体荧光原位杂交( FISH) 技术, 该技术不仅可用于中期分裂相, 还可在间期细胞显示杂交信号, 尤其适用于那些培养难以成功的各种组织细胞。,由细胞到DNA分子,荧光原位杂交技术的基本概念,1.脱氧核糖核酸(DNA)分子 2.脱氧核糖核酸(DNA)探针 3.脱氧核糖核酸(DNA)变性 4.脱氧核糖核酸(DNA)杂交,荧光原位杂交原理,FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸 为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未 知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的 杂交双链核酸。,荧光原位杂交技术,荧光原位杂交技术（简称FISH）是用细胞遗传学和分子生物学的原理，通过荧光标记的核酸探针与细胞内的核酸序列杂交。借助荧光显微镜，在细胞和（或）组织中观察并分析细胞内杂交于靶序列的多种彩色探针信号，以获得细胞内多条染色体或多种基因状态的信息。,荧光原位杂交示意图,常见的荧色物,荧光显微镜系统,探针的标记的种类及比较,1.探针标记方法主要有两类： （1）直接标记法，就是荧光素通过一些方法直接连接到核酸序列上。 （2）间接标记法，就是把地高辛或生物素等半抗原连接到核酸序列 ，然后在杂交过后的检测阶段，加入标记有荧光素的相应半抗原抗体参与反应进行检测。,探针的标记的种类及比较,2. 这两种标记方法相比较而言各有利弊。直接法方便、快捷且背景低，信号强度不及间接法强；间接法具有信号放大系统，信号强检测灵敏度高，但是间接法杂交过后检测步骤繁琐，背景信号强。近年来荧光的亮度和抗淬灭性的不断改进和提高, 直接标记的荧光探针越来越成为首选, 并采用多种不同颜色的荧光, 方便在同一标本上同时检测多种异常. 其荧光强度和信号大小都易于在普通荧光显微镜下观察, 操作过程中也不需要严格避光, 鉴于直接标记法已经可以获得较满意的信号，目前临床检测用的探针多为直接标记法标记。,临床常用的探针,临床使用的探针都是以DNA 为主。 常用探针主要有： （1）着丝粒探针。 CEP:Chromosome Enumeration DNA Probes （2）位点特异型探针。 LSI :Locus specific identifier （3）染色体涂染探针。 WCP: Whole Chromosome Paints,着丝粒探针,a. 高度重复序列DNA ,重复数百次至数千次，其靶序列通常是在染色体的p11-q11区域及异染色质区域。 b. 特点：信号强 c. 应用 (a)标记染色体识别。 (b)染色体数目异常检测。 (c)间期细胞遗传学研究和临床诊断。,着丝粒探针,染色体的着丝粒,异染色质域,位点特异型探针,a . 标记了荧光信号的DNA片段代表了某一个或几个基因位点的全部序列。主要用以染色体DNA 克隆序列的定位和靶DNA 序列拷贝数及结构变化的检测。 b. 特点：信号较小。 c. 应用: （a）定位DNA片段。 （b）确定染色体微小缺失与重复。 （c）间期细胞染色体数目异常诊断。,16号和22号染色体探针信号,位点特异型探针,染色体涂染探针,a. 涂染探针是针对某一整条染色体设计探针，涂染探针主要用于常规显带技术无法确定的染色体重排和标记染色体的确定。能对整条染色体进行荧光标记 b. 特点：结果容易判读。然而，整条染色体涂染 探针不能分辨同一染色体臂间易位及染色体倒位。 c. 应用： （1）染色体数目和结构异常分析。 （2）白血病及其它肿瘤的染色体诊断 和研究。,染色体涂染探针：染色体结构异常分析,FISH技术包括下列几个步骤,1）备制玻片 2）标本变性 3）探针变性 4）杂交 5）DAPI复染 5）荧光显微镜观察FISH结果,羊水标本采集,a. 在B 超腹部探头引导下行羊膜腔穿刺，抽 取羊水20ml，其中15ml 用于常规羊水细胞培 养, 5ml用于FISH 检测。,未培养羊水细胞制片,取羊水5ml， 1800rpm 离心弃上清，加1mg /ml Hanks 胶原酶B 5ml，37 水浴30 min，1800rpm 离心去上清，加0. 075M KCl 5ml，37 水浴低渗20min，加甲醇: 乙酸= 3 1固定液2ml 预固定， 1800rpm 离心去上清，加5ml 固定液轻轻混匀，固定10min，1800rpm 离心去上清，再重复固定1 次，制成细胞悬液，滴片备用。,杂交前预处理,将玻片于2 SSC 溶液中浸泡10min，然后放入0.1MHCl 浸泡10min，再放入2 SSC 溶液中浸泡5min，然后放入预热到37的 0. 01MHCl( 放入玻片前， 0. 01MHCl 中预先加入20mg /ml 胃蛋白酶160l) 中消化8 10min，经过2 SSC 溶液再次浸泡5min 后，用70%、85%、100%乙醇中梯度脱水，每次3min，自然晾干， 56烤片2min。,标本的变性,玻片置73变性液( 70% 甲酰胺) 中 5min，然后分别置于 20的70%、85%、 100% 冰乙醇中各脱水各3min，自然晾干， 45 50烤片。,探针变性,按照比例( 杂交缓冲液: 探针: 水= 7 2 1) 混合，离心1 3s，73 变性5min，45 50 放置5 10min。(允许FISH探针和目标 DNA同时联合变性),杂交,将10l 探针置于杂交区内，覆盖盖玻 片，封片胶封边，置保湿盒恒温42杂交 10 16h。,洗脱,拆片，在46水浴中， 50% 甲酰胺/ 2 SSC 液洗涤3 次，每次7min; 2 SSC 液 洗涤10min; 0. 1% np 40 /2 SSC 洗涤5min。 室温70%乙醇洗涤3min，暗处自然晾干。,DAPI 染色和荧光镜检,DAPI 染色和荧光镜检: 每片加DAPI 10l，盖上盖玻片，染色15 20min，结果用 荧光显微镜观察，选择背景干净、杂交信号清晰 形态圆形或近于圆形的细胞记数，并照像。,临床实验中FISH 结果判别,每张羊水玻片至少计数50 个细胞，判断 标准为: 若正常细胞数90% 则判为正常，若 异常细胞数60% 则判为异常，若异常细胞数 大于15%并且小于60%，则需要重新检测并加 倍计数到100 以上。,FISH 检测结果,采用双色13 /21 号染色体荧光探针检测 13 号、21 号染色体正常胎儿可见2个绿色荧光信号和2 个红色荧光信号。,FISH 检测结果,13 号染色体正常可见2个绿色荧光信号，21 号染色体三体胎儿可见3 个红色荧光信号。,FISH用于产前诊断主要探针,染色体数目异常是临床上最主要的染色体病，其中13号、18 号、21 号、X、Y 染色体数目异常最为常见， 由于13，18，21，X 和Y 这5 种染色体的非整倍体异常约占所有染色体异常的6580，占染色体异常导致出生缺陷的8595， 因此FISH 用于快速产前诊断主要是针对这5 种染色体设计使用荧光标记的探针。,FISH 用于产前诊断的指征,a.妊娠妇女血清学筛查 风险高危者（大于等于1/270)及临界风险者 (小于1/270至大于等于1/1000）。 b.妊娠妇女到预产期时高龄年龄35 岁。 c.双亲之一为易位携带者。 d.不良孕产史。 e.超声检查胎儿异常者。,FISH敏感度和特异度均较高,FISH 用于产前诊断检测的敏感度和特异度均较高。 例1. 有报道FISH 检测4 500 例未培养羊水细胞，对于常染色体的敏感度为92.6%，特异度为100；性染色体敏感度为100，特异度为99.9%。 例2. Tepperberg 等总结美国25 个实验室应用FISH 检测5 348 例羊水资料，结果敏感度为99.6%，特异度为99.98%，阳性预测值为99.8%，阴性预测值为99.96%。 例3. Caine 等回顾性分析24 742 例FISH检测羊水间期细胞的敏感度为99.54%，特异度为99.97%，阳性预测值为99.54%，阴性预测值为99.97%； 由此可见，FISH 用于快速产前诊断的准确性较高。,FISH产前诊断技术临床应用,染色体数目异常是引起新生儿先天性遗传病的主要因素之一。传统的羊水细胞培养、染色体核型分析是宫内产前诊断胎儿染色体疾病的主要方法, 但该方法所需时间长、技术难度大、易受培养条件的影响。对未经培养的羊水间期细胞进行荧光原位杂交检测, 快速诊断胎儿常见的三体型及性染色体数目异常, 具有快速、简便、敏感、特异性强等优点。,FISH产前诊断技术临床应用价值,正常情况下羊水失败率约为0.5%， 超过妊娠24 周后培养失败率升至10%。FISH 检测的成功率2002 年后陆续有大样本研究报道了较为一致的成功率，约为95%98。后随着商品化探针的上市，操作程序规范化后失败率大大降低。传统核型分析最少需要15 mL 羊水标本，而FISH 只需35 mL 羊水。,FISH产前诊断技术在国外应用,FISH 技术最先在美国用于产前诊断，而到2000 年鉴于FISH 技术具有高度的敏感性和特异性，美国医学遗传学会（ ACMG ）宣布FISH 技术可以用于常见染色体数目异常的确诊。此后，FISH 技术在一些发达国家被广泛用于快速产前诊断。检测结果一般可以在2448 h 就可以获得，且检测结果与核型分析结果的一致性可以达到99.5以上。,产前诊断技术临床应用价值,在过去30 年中视核型分析为产前诊断的“金标准”。FISH 技术与核型分析相比，可快速得到结果，该优势能弥补其在诊断准确性方面的欠缺，特别是随着FISH 探针的商品化及实验方法日臻完善，FISH 的可靠性逐步证实，间期细胞核FISH 技术可以提供可靠的产前诊断结果，结果直观且便于解释，满足了临床的需要，有利于临床决策和减轻孕妇过于焦虑的情绪。,FISH 与母源细胞污染,羊膜腔穿刺时母源细胞污染可影响标本质量，导致误诊发生。建议发生严重母血污染时不要进行FISH 检测。影响FISH 结果的母体细胞来源羊膜腔穿刺中母体的淋巴细胞， 这些细胞在体外培养时不会生长。出现母体细胞污染的原因很大程度上与临床标本采集时操作有关。因此临床羊膜腔穿过程中应尽量避开胎盘穿刺，对最初抽出的24 mL 羊水改行其他检测。,稽留流产与染色体异常,孕早期胚胎染色体异常是稽留流产最重 要的原因的原因之一，自然流产中胚胎染色体异 常占50%左右，而胚胎染色体数目异常，包括整 倍体和非整倍体，为其发生的重要因素。,FISH应用于流产胚胎绒毛,绒毛染色体检查是诊断胎儿染色体异常的可靠依据。由于绒毛染色体制备成功率易受其取材时间及标本质量的影响，常造成标本分裂相少或染色体形态不佳等状况，给诊断带来困难。而FISH 分析无需作细胞培养及显带分析，仅作细胞计数，其优势是不仅适用于分裂中期的染色体，也适用于间期核及细胞周期的所有阶段。,FISH应用于流产胚胎绒毛,选用13、16、18、21、22、X和Y染色体上 的探针对未培养的绒毛组织进行荧光原位杂交来诊 断染色体异常，杂交信号明亮,敏感度高,特异性 强，克服了流产绒毛组织易污染导致细胞培养不成 功，核型分析困难等导致结果难出的尴尬局面。,FISH应用于流产胚胎绒毛,胎儿自身的遗传学异常才是导致早期流产的主要原因，绒毛染色体FISH分析可对自然流产的原因及时作出遗传学方面的判断，尤其是对高危因素的流产绒毛常规行染色体FISH检测是有必要的。对习惯性自然流产的高危因素及其临床绒毛染色体的分析研究，不仅能够为稽留流产的病因学研究提供理论依据，而且对患者再次妊娠的治疗也具有指导作用，因此开展流产胚胎绒毛组织的FISH染色体检查是相当有意义的。,流产胚胎绒毛FISH图,16号染色体探针信号三个（绿色） 22号染色体探针信号三个（红色）,流产胚胎绒毛FISH图,13号染色体探针信号三个（绿色） 21号染色体探针信号三个（红色）,流产胚胎绒毛FISH图,18号染色体探针信号2个（蓝色） X染色体探针信号1个（绿色） Y染色体探针信号1个（红色）,FISH技术在外周血临床应用,传统核型分析可发现染色体数量异常和长度达5 Mb10Mb 的结构性异常。因此传统核型分析已经到达了检测的极限。,FISH技术在外周血临床应用,FISH 与常规的染色体显带分析法相比, 快速、不需体外培养、在极短的时间内分析的细胞数目比常规染色体分析数目多10 倍，更容易检测出嵌合体类型，做出的结论更加准确。还可辅助及确定对一部分显带染色体技术不易分辨的结构异常的确切诊断。例如: 额外的微小标记染色体及亚带水平上的微小片段的重复、易位、插入、缺失等。,FISH图,46,XY,t(11;22)(q23;q11) 用22号染色体探针（绿色）,FISH图,46,XY,t(13;22)(q12；q11) 用22号染色体探针（绿色）,FISH在细胞遗传学应用小结,随着我国自行合成标记探针种类的增加、 价格的降低， FISH 技术对染色体异常导致的出生 缺陷的快速产前诊断、流产胚胎染色体异常的查因 及显带技术不易分辨的结构异常的确切诊断方面将 会在各地普及推广，在临床治疗及研究中将会发 挥更重要的作用。,后面内容直接删除就行 资料可以编