课件：第六章细菌、病毒.ppt

七、转化（transformation）,概念：某些细菌通过其细胞膜摄取周围供体的染色体 片段，将此外源DNA片段通过重组整合到自己 染色体组的过程。 1928年，格里费斯（Griffith F.） 在肺炎双球菌中发现转化现象。 1944年，阿委瑞（Avery O. T.） 进行肺炎双球菌转化试验； 证实遗传物质是DNA； 转化是细菌交换基因的方法之一。,2019,-,1,转化的条件：细菌活跃摄取外源DNA分子； 具备重组程序所必需的酶。 转化三种细菌：肺炎双球菌； 枯草杆菌； 流感嗜血杆菌。 转化的两个例子： 用两个带有不同抗性的肺炎双球菌群体混合可以发现带有双抗性的细菌。 细菌裂解DNA残留其它细菌摄取转化。 枯草杆菌活细胞表面分泌DNA，可被其它细胞摄取。,2019,-,2,（一）供体与受体的互作： 转化片断的大小： 肺炎双球菌转化：DNA片断至少有800bp； 枯草杆菌的转化：DNA片断至少有16000bp。 供体DNA分子存在的数目： 供体DNA分子数目与特定基因的成功转化有关。 链霉素抗性基因转化：每个细胞含有10个DNA分子之前，抗性转化体数目一直与DNA分子存在数目成正比。 原因：细菌的细胞壁或细胞膜上有固定数量的DNA接受座位，故一般细菌摄取的DNA分子数10个。,2019,-,3, 受体的生理状态： 感受态是处于刚停止DNA合成、而蛋白质合成继续活跃进行时的状态。 活跃合成的蛋白质可使细菌细胞壁易于接受转化DNA。 只有感受态受体细胞才能摄取并转化外源DNA，而这种感受态也只能发生在细菌生长周期的某一时间范围内。,2019,-,4,（二）转化DNA的摄取和整合过程： 结合与穿入： 双链DNA分子结合在受体座位上（可逆），可被DNA酶降解；接受座位饱和性。 DNA摄取(不可逆)，不受DNA酶破坏。 穿入后，由外切酶或DNA移位酶降解其中一条链。 联会： 按各个位点与其相应的受体DNA片段联会。亲缘关系越远，联会越小、转化的可能性越小。,2019,-,5, 整合(重组)： 是指单链的转化DNA与受体DNA对应位点的置换稳定地进入到受体DNA。 对同源DNA具有特异性。异源DNA，视亲缘关系远近也可发生不同频率整合。,2019,-,6,（三）连锁判断 如果A和B是连锁的，当DNA浓度下降时，AB同时转化频率和A或B转化频率下降程度相同； 如果A和B不连锁，AB转化频率下降将远远超过A或B转化频率下降的程度，因为在较低的浓度范围内，转化频率和转化DNA的浓度成正比关系。,2019,-,7,（四）转化频率低的原因： 1.受体细菌细胞壁只在特定区域形成临时通道，允许外源片段通过。 .外源进入还必须有酶或蛋白质分子以及能量的协同作用。,2019,-,8,（五）细菌的转化与作图 转化中供体DNA片段可以携带若干个基因，连锁基因可同时被转化，但同时被转化的基因不一定连锁。,2019,-,9,黎德伯格等用枯草杆菌进行转化和重组试验： DNA 片段进入受体细胞后，可与受体染色体发生重组。紧密连锁的两个基因有较多的机会在同一个DNA片段中同时整合到受体染色体中。,2019,-,10,枯草杆菌菌株trp2+his2+tyr1+ 作为供体，提取其DNA向受体trp2-his2-tyr1-菌株进行转化。 trp2+his2+tyr1+ trp2-his2-tyr1-,2019,-,11,2019,-,12,2019,-,13,第三节 噬菌体的遗传分析,Micrograph of a bacteriophage attaching to a bacterium and injecting its DNA,2019,-,14,一、噬菌体的结构： 1. 结构简单： 蛋白质外壳、核酸、某些碳水化合物、脂肪等。 2. 多样性的原因：外壳的蛋白质种类、染色体类型和结构。 3. 两大类： 烈性噬菌体：T噬菌体系列（T1T7）； 温和性噬菌体: P1和噬菌体。,T4噬菌体从大肠杆菌中释放,2019,-,15,（一）烈性噬菌体,1.概念： 烈性噬菌体（virulent phages）：感染宿主细胞后就进入裂解反应，使宿主细胞裂解。,2019,-,16,2.结构大同小异，外貌一般呈蝌蚪状： T偶列噬菌体,颈部：中空的针状结构及外鞘；,尾部：由基板、尾针和尾丝组成。,头部：双链DNA分子的染色体；,2019,-,17,3.T偶列噬菌体的侵染过程（如T4噬菌体） 尾丝固定于大肠杆菌，遗传物质注入破坏寄主细胞遗传物质降解细菌的染色体，为自身DNA合成提供游离的核苷酸， 合成噬菌体遗传物质和蛋白质组装许多新的子噬菌体溶菌酶裂解细菌释放出大量噬体。,T4噬菌体侵染大肠杆菌的生活周期,2019,-,18,Phage T4,show in its free state and in the process of infecting an E.coli cell,2019,-,19,A generalized bacteriophage lytic cycle,2019,-,20,（二）温和噬菌体,1.概念： 温和（溶源性）噬菌体（temperate phages）：感染宿主细胞后具有裂解和溶源两种发育途径。 例如：和P1噬菌体，和P1各代表一种略有不同的溶源性类型。,2019,-,21,2.溶源性噬菌体的生活周期： 噬菌体：噬菌体侵入后，细菌不裂解附在E.coli染色体上的gal和bio位点间的att座位上整合到细菌染色体，并能阻止其它噬菌体的超数感染。, 噬 菌 体 特 定 位 点 的 整 合,2019,-,22, P1噬菌体： 不整合到细菌的染色体上，而是独立存在于细胞质内。,2019,-,23,原噬菌体：整合到宿主基因组中或在染色体外以游离形式存在的噬菌体。 仅少数基因活动，表达出阻碍物关闭其它基因。 原噬菌体经诱导可转变为烈性噬菌体 裂解途径。,2019,-,24,3.P1和噬菌体的特性： P1和各代表不同的溶源性类型： P1噬菌体：侵入后并不整合到细菌的染色体上，独立存在于细胞质内； 噬菌体：通过交换整合到细菌染色体上。 溶源性细菌分裂 两个子细胞： P1噬菌体复制则使每个子细胞中至少含有一个拷贝； 噬菌体随细胞染色体复制而复制，细胞中有一个拷贝。 共同特点：核酸既不大量复制，也不大量转录和翻译。,2019,-,25,P1和噬菌体的生活周期特性,2019,-,26,温和噬菌体的感染周期 生活周期分为,裂解途径,溶源途径,裂解周期（lytic cycle）,溶源周期（lysogenic cycle）,2019,-,27,Alternative cell cycles of a temperate phage and its host,2019,-,28,溶源性细菌（lysogenic bacterium）：带有某种噬菌体，但并不立即导致溶菌的现象称为溶源性，这样的细菌就称为。 非溶源性细菌（non- lysogenic bacterium）：失去原噬菌体的细菌称为。,2019,-,29,溶源性细菌有两个重要特性： 1.免疫性：细菌细胞内已有了侵入的噬菌体，再也不会受到同一种噬菌体的侵染。 2.可诱导性：通常由于原噬菌体的自发诱导，每一代可能有万分之一溶源性细菌被裂解，释放出大量噬菌体，这一过程称为裂解周期。用紫外线或化学物质诱导，90%的溶源性细菌进入裂解周期，完成组装的完整噬菌体释放出来。,2019,-,30,二、溶源性的遗传基础,原始E.coli菌株对于温和噬菌体来说是溶源菌。如果F+与F-细胞间进行杂交，发现杂交结果与所用的溶源菌菌株有关。,2019,-,31,Zygotic induction,2019,-,32,正交F+ () F-，即F+细胞是带有噬菌体的溶源菌时，几乎不产生溶源性重组子。 在Hfr() F-中，Hfr菌株的前端基因可在F-受体中出现，但后端基因的重组子得不到。,2019,-,33,反交F+ F- ()，即F-细胞是带有噬菌体的溶源菌时，可偶尔产生溶源性重组子。 在杂交HfrF-()中， Hfr基因转移到F-细胞，所以有Hfr基因的溶源性F-重组子很容易得到。,2019,-,34,合子诱导（zygotic induction）：溶源性Hfr与非溶源性F-受体杂交时，经过一定时间，原噬菌体进入一个无免疫能力的细胞，原噬菌体随即开始复制，使细胞裂解，释放出游离的噬菌体，这个现象叫。 原噬菌体进入非溶源性细胞后，使受体细胞裂解，这样在噬菌体转移以后才进入F-细胞的Hfr后端基因就无法得到了。,2019,-,35,三、噬菌体突变的基因重组与作图,1.噬菌体遗传性状分为两类： 形成的噬菌斑形状： 指噬菌斑大小、边缘清晰度、透明程度。 寄主范围： 指噬菌体感染和裂解的菌株范围。,2019,-,36,2 T2突变型的两点测交 正常噬菌体r+： 缓慢溶菌，噬菌斑小而边缘模糊。 r 突变体（rapid lysis，速溶性）： 快速溶菌，噬菌斑大而边缘清楚。 寄主范围突变体： 指能克服噬菌体抗性的突变体。 例：h+ 噬菌体：只侵染大肠杆菌B株半透明噬菌斑。 h突变株：能利用B株和B/2株透明噬菌斑。,2019,-,37, 双重感染： h和h+均能感染B株可用T2 两个亲本hr+和h+r同时感染B菌株。 hr+(透明，小)h+r (半透明，大) 同时感染B菌株 获得噬菌体子代 亲本型： hr+，h+r 重组型：hr， h+r+,2019,-,38,将亲本型和重组型混合子代 感染 混合有B和B/2菌株的培养基 hr+(亲)： 噬菌斑透明、小，边缘模糊 h+r (亲)： 噬菌斑半透明、大，边缘清楚 hr (重组)：噬菌斑透明、小，边缘清楚 h+r+(重组)： 噬菌斑半透明、小，边缘模糊,2019,-,39, 重组值计算： 重组值=重组噬菌斑数/总噬菌斑100% = (h+r+ + hr)/(h+r+ hr+ + h+r+ + hr)100% 去掉%即可作为图距。,2019,-,40,A double infection of E.coli by two phage,2019,-,41,Plaque phenotypes produced by progeny of the cross h r h r ,2019,-,42,2019,-,43,不同的快速溶菌突变型在表型上不同，记作ra、rb、rc，用不同快速溶菌突变型h+rx-与宿主范围突变型h-rx+杂交。重组值随着r基因的不同而有变化，可以据此作连锁图。,2019,-,44,h+r-h-r+获得试验结果列于下表： 分别作出ra 、 rb 、 rc与h的三个连锁图:,2019,-,45,四种可能的基因排列连锁图: ？ 1 2 3 4,2019,-,46,再做杂交：rcrb+ rc+rb 结果表明: rcrb的重组值 rbh h 位于rb及rc之间，排列顺序 rchrb。 由于T2 噬菌体的连锁图是环状的，所以2、3排列都对。,2019,-,47,3.T4突变型的三点测交 在噬菌体中也可以用三点测交进行基因定位。 用T4噬菌体的两个品系感染大肠杆菌。 一个品系m：小噬菌斑 r：快速溶菌 tu：浑浊溶菌斑 另一个品系是对这三个性状都是野生型+。,2019,-,48,T4的m r tu+ + +三点测交结果,2019,-,49,根据这些结果，可绘制出这三个基因的染色体图： m 12.9 r 20.8 tu 三点测交所得的8种噬菌斑都可观察到，因为病毒是单倍体，亲本型与重组型可直接从后代中表现出来，直接统计各种噬菌斑类型即可，不必考虑对子代如何进行选择。,2019,-,50,四、转导（transduction）,1.概念：指以噬菌体为媒介进行的细菌遗传物质重组， 是细菌遗传物质传递和交换方式之一。 2.特点： 以噬菌体为媒介细菌的一段染色体被错误地 包装在噬菌体的蛋白质外壳内通过感染转移到另 一个受体细胞内。 感染细菌的能力决定于噬菌体的蛋白质外壳。,2019,-,51,（一）普遍性转导（generalized transduction）：可以转移细菌染色体的很多不同部分，这类噬菌体的转导叫做。 黎德伯格与津德（1951）发现鼠伤寒沙门氏菌中转导现象。 （1）将两个沙门氏菌的营养缺陷型进行杂交： phe- trp- tyr- met+ his+ phe+ trp+ tyr+ met- his- 混合培养 在基本培养基发现原养型的菌落 频率为1/105 但在使用戴维斯U形管时也出现了原养性菌落。,2019,-,52,（2）产生上述结果的原因: 是否属于恢复突变? 高频率出现不可能是回复突变。 是否属于接合、性导? 戴维斯U型管试验(防止细胞直接接触) 结果也获得野生型重组体，排除由于接合或性导而产生基因重组可能性。 是否属于转化? 结果表现为不受DNA酶的影响，排除了由于DNA片断通过滤片经转化实现基因重组可能性。,2019,-,53,（3）唯一可能的结论是：这种重组通过一种过滤性因子实现。 这种过滤性因子称为FA，不受DNA酶的影响。FA为噬菌体P22（溶源性）。,2019,-,54,滤板孔径允许这种因子通过，因此称为过滤因子，而这种因子大小和质量与P22相同； 免疫学实验验证这种因子可以被P22抗血清灭活； 如果用抗性品系来代替敏感品系，那么在U型管的两端都不出现野生型重组了。 进一步研究也验证了细菌菌株是携带P22原噬菌体的溶源性细菌。,2019,-,55,P22在感染细菌细胞时，细菌染色体断裂成小片段。在形成噬菌体颗粒时，偶尔错误地把细菌染色体的片段组装到头部，而不是他们自己的遗传物质。,2019,-,56,转导噬菌体（transducing phage）或转导颗粒（transducing particles） ：把细菌染色体片段包装在噬菌体蛋白质外壳内而产生的假噬菌体（不包含噬菌体的遗传物质）。,2019,-,57,决定噬菌体的吸附和注入DNA这两种功能取决于它的蛋白质外壳，所以转导颗粒可以吸附到细菌细胞上，并注入他们的DNA。此时噬菌体DNA中包含了部分的细菌基因。,2019,-,58,当转导噬菌体内容物注入一个受体细胞后，形成一个部分二倍体，然后导入的基因通过重组，整合到宿主细菌的染色体上。,错误包装(1/1000机率),同源重组,同源重组,2019,-,59,噬菌体携带供体的染色体片段完全是随机的，也就是说，供体基因组中所有基因具有同等机会被转导形成部分二倍体，经交换和重组后，形成不同转导子。 各个标记基因转导频率大致相同，这种转导就是普遍性转导（general transduction）。,2019,-,60,The mechanism of generalized transduction.,2019,-,61,转导噬菌体一般只有0.3%左右 噬菌体基因组大小相当于沙门氏菌的1% 普遍性转导频率很低，对每一个基因来说转导频率是有限的。 频率：1%0.3%=310-5,2019,-,62,如果细菌的两个基因之间距离大于噬菌体的染色体长度，一般不能同时进行转导，除非携带不同基因颗粒同时感染同一细菌细胞。 频率： 10-5 10-5=10-10,2019,-,63,共转导或并发转导（cotransduction）：两个基因同时转导的现象。 如果两个基因始终是一起转导或同时转导频率较高，那么可以证明这两个基因是连锁的。两个基因共转导频率愈高，表明两个基因连锁愈紧密，相反，共转导频率愈低，则表明这两个基因距离愈远。,2019,-,64,双因子转导（two-factor transduction）：每次观察两个基因的转导，通过每两个基因之间的共转导频率可以确定这些基因在染色体上的次序。 若要分析个基因则需做次双因子转导实验，才能确定这个基因的次序。,2019,-,65,假定这次实验结果为：a基因和b基因共转导的频率高；a基因和c基因共转导频率也高； b和c基因的共转导频率很低，那么这个基因的次序就应为b、a、c。,2019,-,66,三因子转导（three-factor transduction ）分析，则只做一次实验就可推出个基因的次序。 以普遍性转导噬菌体P1为例，测定大肠杆菌的leu（亮氨酸合成)、thr（苏氨酸合成）、azi(叠氮化钠抗性）三个基因的顺序。,2019,-,67,2019,-,68,每个选择的标记基因进行多次试验： 三个位点之间的连锁关系： 实验1： 2种可能排列： azi leu thr leu azi thr 实验2：肯定三个基因的顺序是： azi leu thr 实验3： 证明这一顺序，因为leu+和thr+片段之间从未携带有azir。,2019,-,69,通过合转导关系求出两基因之间的物理距离： d=同一染色体上两基因之间的物理距离； L=转导DNA的平均长度； X=两个基因共转导的频率。 由以上公式可知： 转导DNA的平均长度约为个病毒基因组的大小； 通过试验测知两个基因的合转导频率，就可估算出两个 基因间的物理距离。,2019,-,70,通过3因子转导可以得到不同类型的转导子及其频率，显然频率最低的一类转导子是最难于转导的，因为它的产生需要同时发生的交换次数最多。这种转导子的3个基因中，两边的应为供体基因，中间的受体基因。,2019,-,71,例如：大肠杆菌leu+arg+met+细胞作供体， leu-arg-met-作为受体，由P1噬菌体作为载体进行转导。最初选择的是leu+转导子，然后检查leu+转导子中其他两个基因被转导的情况，得到的转导子类型和数目如下：,2019,-,72,(1) leu+ arg- met- 453 (2) leu+ arg+ met- 114 (3) leu+ arg+ met+ 36 (4) leu+ arg- met+ 0 603,2019,-,73,Incorporation of a late marker into the F E.coli chromosome,2019,-,74,可见： 第四类基因型的转导子是很难发生的，由此类转导子基因型可以看出这三个基因的排列次序是leu arg met； leu+和arg+在第二、三类转导子中是共转导，而在第一、四类转导子中不是共转导，所以这两个基因共转导频率为（36+114）/603=0.25； leu+和met+仅在第三类转导子中共转导，所以共转导频率为36/603=0.06。,2019,-,75,如果两个基因紧密连锁，它们就有可能经常在一起转导，共转导频率将接近1。如果两个基因从未或几乎未包含在同一转导的DNA片段中，那么它们的共转导频率接近于或等于0。,2019,-,76,利用转导作图也和转化作图一样，最好在中断杂交基础上进一步精确定位，同时只是对局部基因定位有效。,2019,-,77,普遍性转导中，在基本培养基上除了正常菌落外，还有大量小菌落，这两者之比大约1：10，这一现象称为流产转导（abortive transduction）。 转导噬菌体虽然将供体野生型基因导入受体，但是只有10%的可以重组入受体染色体中形成完全转导（complete transduction ），即在基本培养基上形成正常菌落。,2019,-,78,90%的供体野生型基因并未重组入受体染色体中，因而也不能复制，当这些细胞分裂时，只有一个细胞得到这一基因，这一过程一再发生，供体这一野生型基因便一直沿着单个细胞传递下去，这称为单线遗传。凡是没有得到供体这一基因的细胞不能合成相应的酶，但仍含有母细胞残留的酶，可供这些细胞继续分裂一两次，所有的这些细胞将形成小菌落，称为流产转导型。,2019,-,79,（二）特异性转导,特异性转导（specialized transduction）：只转移细菌染色体的特定部分的这类噬菌体的转导叫做或局限性转导（restricted transduction）。 由温和噬菌体进行的转导。,2019,-,80,特定位点attB整合,2019,-,81,温和噬菌体 自主状态存在 整合到细菌染色体中（特定位点attB）原噬菌体。,半乳糖操纵子gal基因,生物素合成基因bio,2019,-,82,原噬菌体离开细菌染色体时偶尔出错某些细菌基因+噬菌体基因混杂的DNA片段由噬菌体外壳包装局限性转导颗粒。 这种颗粒可将细菌基因由供体细胞转移至受体细胞，只是这种转导仅限于靠近原噬菌体附近的基因，如噬菌体专门转导大肠杆菌的gal或bio基因。,2019,-,83,在局限性转导颗粒中，被包装的DNA总长度与噬菌体基因组长度相当，否则就难以包进噬菌体的头部外壳中，那么在局限性转导颗粒中既然加进一段细菌的DNA，必然要减少相应长度的一段噬菌体自身的DNA。所以这种转导噬菌体是有缺失（defective）的，因此用dgal或dbio表示。,2019,-,84,以噬菌体为例：dgal颗粒形成过程：,2019,-,85,这种有缺失的噬菌体转导后，gal+菌株在裂解时也不产生成熟的颗粒，而且局限性转导噬菌体发生几率很低，故用这种噬菌体群体感染非溶源性的gal-的受体细胞后，转导子出现的频率只有10-6，所以称低频转导（low frequency transduction,LFT）。,2019,-,86,转导子形成过程不像转化和普遍性转导那样是供体基因置换受体基因，而是dgal+DNA进入受体后，通过特定位点配对、交换，然后dgal+DN