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文档简介
实验三 血红蛋白及其衍生物 的吸收光谱测定,生物技术专业实验室 王小英,一、实验目的,1、熟悉Hb及其衍生物吸收光谱测定的原理及操作方法。 2、掌握吸收光谱曲线绘制的方法。,1、吸收光谱曲线：将各种波长（）的单色光依次通过一定浓度的某一溶液，测量该溶液对各种单色光的吸收程度（吸光度A），以为横坐标，以A为纵坐标，可得到一条曲线，即吸收光谱曲线或称为吸收曲线。,二、实验原理,2、吸收曲线的特点,同一种物质对不同波长光的吸光度不同。 吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长max 。 不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似max不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和max则不同。 在max处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。,3、血红蛋白（Hemoglobin，简称Hb）,血红蛋白四聚体结构模式,4、Hb及其衍生物,吸收峰数量,峰 值,2个 541nm，576nm,2个 540nm，569nm,1个 540nm,1个 555nm,HbO2 + K3Fe(CO)6 + NaCN MetHbCN,500650nm,图1 HbO2吸收光谱,图2 HbCO吸收光谱,图-3 MetHbCN吸收光谱,图-4 脱氧Hb吸收光谱,三、操作步骤,1、样品制备 （1）HbO2液： 取全血0.1ml（1滴）盛于小烧杯中，加蒸馏水10ml，混匀，此即HbO2液。,（2）MetHbCN液： 取上述氧合血红蛋白约5ml于小试管中，加新鲜配制的10%K3Fe(CN)6 2滴，然后加1滴1%NaCN液，混匀，此即为MetHbCN液。,(3)混匀，静置5min。,2、比色,将以上制备的两种血红蛋白液分别盛于比色杯内，在722型分光光度计上以蒸馏水为空白调节0和100%。在500650nm分别测定HbO2和MetHbCN液的吸光度（*在相应峰值的10nm范围内每隔5nm记录一次吸光度读数，其余均每隔10nm记录一次吸光度读数）。,四、结果记录及曲线绘制,以波长为横坐标，吸光度为纵坐标描点，并将各点连接成光滑曲线，即为血红蛋白及其衍生物的吸收光谱。,2、绘制吸收曲线（*并确定最大吸收波长）,1、记录各波长下的A（制成表格）,四、注意事项,1、NaCN溶液是剧毒物，要注意安全，切忌口服，实验完毕注意洗手。 2、取全血前要混匀。 3、比色时每次换波长都要重新调零和100%。 4、绘图时，纵横坐标比例要适
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