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CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 1 简介 . 1 原理： . 1 应用： . 4 技术介绍： . 6 技术优缺点： . 9 简介简介 CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防 御，可用来对抗入侵的病毒及外源 DNA。CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体 和质粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中， 并利用相应的 CRISPR RNAs （crRNAs） 来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。 CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列 R( repeat) 与长 度相似的间区序列 S( spacers) 间隔排列而成的 CRISPR 簇，前导序列 L( leader) 以及一系列 CRISPR 相关蛋白基因 cas。 Cas 蛋白是一种双链 DNA 核酸酶，能在 guide RNA 引导下对靶位点进行切 割。它与 folk 酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。 原理：原理： 此系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合 物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通 过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的 sgRNA （short guide RNA ） ，足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。 作为一种 RNA 导向的 dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第 一个统一因子（unifying factor） ，能够共定位 RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨 大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的 Cas9（ Cas9 nuclease-null）融合，并表达 适当的 sgRNA ，可靶定任何 dsDNA 序列，而 sgRNA 的末端可连接到目标 DNA，不影响 Cas9 的结合。因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列处带来任何融 合蛋白及 RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。 1. CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 首先识别入侵的核酸和扫描外源 DNA 潜在的 PAM（NGG 序列） ，将临近 PAM 的序列作为候选 protospacer； 然后在 CRISPR 基因座的 5端合成重复序列； 最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间。 2. CRIPSR 基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工)： 当该噬菌体再次入侵细菌时，CRISPR 簇首先转录为长的 crRNA 前体，然 后逐步被加工成小的成熟的 crRNA。 3. CRISPR/Cas 系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰 crRNA 结合相关的 Cas 蛋白后， 形成 crRNA-Cas 蛋白复合体， 通过碱基互 补配对精确地与目标 DNA 相结合， 随后 Cas 蛋白对目标 DNA 进行断裂和降解。 4. 应用：应用： 基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、 寻找合适药 物作用靶标的重要工具。 但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、 ES 细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很 高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较 成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。 2013 年 1 月份，美国两个实验室在 Science杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不 同， 是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点， 从而 对特定基因位点进行切割导致突变。 该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动 物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点 突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的 基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到 在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用 CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相 关 G 蛋白偶联受体 Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因 突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的 构建敲除动物模型的新方法。 CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶 （ZFN） 、 ES 细胞打靶和 TALEN 等技术 后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、 生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。 基因组编辑技术是一种可以在基因组水平上对 DNA 序列进行改造的遗 传操作技术。 这种技术的原理是构建一个人工内切酶， 在预定的基因组位置切断DNA， 切断的 DNA 在被细胞内的 DNA 修复系统修复过程中会产生突变， 从而 达到定点改造基因组的目的。 通过修复途径， 基因组编辑技术可以实现三种基因组改造， 即基因敲除， 特异突变的引入和定点转基因。 基因组编辑是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人类遗传性疾 病的治疗，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点。 技术介绍：技术介绍： 目前，来自 Streptococcus pyogenes 的 CRISPR-Cas9 系统应用最为广泛。 Cas9 蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割 DNA 两条单链。Cas9 首 先与 crRNA 及 tracrRNA 结合成复合物，然后通过 PAM 序列结合并侵入 DNA， 形成 RNA-DNA 复合结构， 进而对目的 DNA 双链进行切割， 使 DNA 双 链断裂。由于 PAM 序列结构简单（5-NGG-3 ） ，几乎可以在所有的基因中找 到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9 系统已经成功应用于植物、 细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。 通过基因工程手段对 crRNA 和 tracrRNA 进行改造，将其连接在一起得到 sgRNA （single guide RNA） 。 融合的 RNA 具有与野生型 RNA 类似的活力， 但因为结构得到了简化更方便研究者使用。 通过将表达 sgRNA 的原件与表达 Cas9 的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对 目的基因进行操作。 基因敲除的实验过程基因敲除的实验过程 1、在把基因序列中寻找 NGG 序列获得其附近 20 多个碱基的序列，与 tracrRNA 序列融合，设计出 sgRNA 并合成该序列。 2、将该序列以及 cas9 基因连入如图所示载体。 3、转化感受态，质粒小提，测序验证。 4、细胞培养与细胞转染 5、敲除效果检测。 6、建立稳定敲除的细胞株 Cas9 质粒构建质粒构建 虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果，但是质粒转染具有效率低，作用 时间短暂性等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题，常用的病毒主要有慢病毒 和腺病毒，慢病毒常用质粒见 addgene（lentiCRISPR v2，lentiGuide-Puro， lentiCas9-Blast） ，慢病毒可以整合入宿主基因组中，长期稳定的表达（汉恒生物 提供 CRISPR/cas9 慢病毒包装） ，但是由于慢病毒克隆能力有限而 CAS9 本身 分子量比较大（大于 4kb） ，且长期插入可能导致乱切，脱靶等，同时慢病毒包 装最终获得的滴度不高等原因，腺病毒更有优势，腺病毒克隆能力强，获得的病 毒滴度也高。同时相对于普通质粒来说，作用是时间也比较长，可以达到更理想 的敲除效果。 技术优缺点：技术优缺点： CRISPR （Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats） 是细菌用来 抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。 科学家们利用 RNA 引导 Cas9 核酸酶可在多种细胞 （包括 iPS） 的特定的基因组位点上进行切割， 修饰。 Rudolf Jaenisch 研究组将Cas9与Te1和Tet2特异的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中， 成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达 80%。 他们将 Cas9/sgRNA 与带 突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在 ES 细胞 中他们更是成功的一次敲除了五个基因。与 ZFN/TALEN 相比，CRISPR/Cas 更 易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在