特殊细菌药敏试验的规范化操作.doc

特殊细菌药敏试验的规范化操作一、目前我国细菌药敏试验现状20年以来，我国在卫生部和各地临床检验中心和检验学会的共同努力下引进CLSI药敏系列标准，使全国微生物实验室能在同一标准下进行质量控制活动。当前，微生物实验室对常见临床分离细菌的药物敏感试验的水平已有了显著的提高，但对特殊细菌的药敏试验的各个环节的规范操作还不能得到普及，对目前还无折点的细菌能否做药敏试验，以及如何判断细菌的药物敏感和耐药，仍然概念模糊，有待进一步规范和普及。 目前常见错误做法： （一）铜绿假单孢菌的药敏判断标准用于其他非发酵细菌；嗜血杆菌的标准用于卡他莫拉菌等的错误做法时有发生。 （二）借用同属细菌敏感标准 （三）借用同类抗生素的敏感标准 二、各菌属的药物敏感性报告及试验方法的CLSI药敏标准 （一）“嗜麦芽”菌属药敏报告标准1.CLSI对“嗜麦芽”纸片药敏判断标准 药物名称 纸片含量ug/片 耐药 R中介I敏感S米诺环素 301415-1819左氧氟沙星 51314-1617复方新诺明 1.25/23.751011-15162.CLSI对“嗜麦芽”稀释法判断标准药物名称 SIR替卡西林/棒酸 16/232/2-64/2128/2头孢他定 81632米诺环素 4816左氟沙星 248复方新诺明 2/38-4/76氯霉素 81632（二）无折点细菌的药物敏感试验报告1. 其他药物的敏感性报告: CLSI推荐的药物可以报告MIC值和敏感度（S、I、R）， 临床需要的其他药物的药敏试验报告可以直接报告MIC值但不报告S、I、R。2. 不要用认为相近细菌的折点代替报告S、I、R，这会误导医生用药。 （三）洋葱伯克霍德菌的药物敏感试验1.CLSI 洋葱伯克霍德菌纸片法折点：药物名称 纸片含量Ug/片 RIS头孢他定 301718-2021美罗培南 101510-1920米诺环素 301415-1819复方新诺明 1.25/23.751011-15162. CLSI洋葱伯克霍德菌稀释法折点 ：药物名称 SIS替卡西林/棒酸 16/232/2-64/2128/2头孢他定 81632美罗培南 4816米诺环素 4816左氟沙星 248氯霉素 81632复方新诺明 2/38-4/76（1）氯霉素不常规报告结果,只有在尿路感染时分离的细菌才报告结果。（2）在纸片法药敏中只允许报告表中4个药物的敏感性,对其他药物可用于临床治疗但还没有足够的研究建立纸片扩散的折点。（四）莫拉菌属的药物敏感试验报告 莫拉菌属至今尚无由CLSI颁布的标准操作方法和敏感性折点,该菌属是人体皮肤、黏膜、呼吸道正常细菌，很少会致病，有过报道的病例有该菌属引起的眼结膜炎、气管炎、肺炎、脑膜炎、脑脓肿、心包炎和心内膜炎。实验室药敏报告只能报告MIC值但不能报告敏感性。文献报告的资料是推断性。 （五）金黄杆菌属的药敏试验报告脑膜败血性黄杆菌是最常见于临床标本，是条件致病菌，有文献报道的病例有新生儿脑膜炎，对成人很少致病，感染与插管有关。CLSI未颁布标准操作方法和敏感折点，药敏试验可报告MIC值。该菌属耐药特点：对氨基糖甙类、-内酰胺类、四环素类、氯霉素类天然耐药；对治疗革兰阳性细菌药物利福平、红霉素、克林霉素、司帕沙星、复方新诺明和万古霉素敏感。 （六）丛毛菌属和食酸菌属的药敏试验 推荐用肉汤稀释方法或E-test方法，报告MIC值，不适合用纸片药敏方法。 （七）产碱杆菌属、无色杆菌属和苍白杆菌属的药敏试验 目前无药敏解释标准，建议采用稀释法药敏试验方法，报告MIC值，根据MIC和组织浓度判断敏感性。1粪产碱杆菌是产碱杆菌的代表株对氨苄西林、氨曲南和庆大霉素耐药。2木糖氧化无色杆菌 木糖氧化亚种是临床常见的分离株，对氨苄西林、氨基糖甙类、非抗假单孢菌的头孢菌素、氟喹诺酮和氯霉素耐药，但对派拉西林、替卡西林/棒酸、亚胺陪南、复方新诺明及抗假单孢菌头孢菌素敏感。3人苍白杆菌是苍白杆菌属代表菌，对-内酰胺类耐药，但对亚胺陪南、复方新诺明、氨基糖甙类、氟喹诺酮类和四环素敏感。 （八）布鲁杆菌属药敏试验不推荐做体外药敏试验，-内酰胺类耐药和氟喹诺酮类有高的体外活性与临床疗效不一致。热病推荐首选药物是多西环素加庆大霉素或链霉素。（九）军团菌药敏试验 目前无标准的试验方法和解释标准，肉汤稀释和E-test方法报告MIC值可作参考。首选用药大环内脂类、喹诺酮类，对-内酰胺类体外敏感但体内疗效差。（十）弯曲菌科细菌的药敏试验 1弯曲菌科包括弯曲菌属、弓形菌属和螺菌属。目前无解释标准。CLSI M100-S16 2006年文件仅提供了质控菌株对部分抗生素的可接受范围和质量控制标准操作程序。2常寄生于人的牙周黏膜，可引起人胃肠炎和腹泻，胎儿弯曲菌可引起免疫低下患者菌血症。热病推荐对空肠弯曲菌首选药物为红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、多西霉素和克林霉素。幽门螺杆菌对克林霉素的折点是1ug/ml并与临床疗效一致，甲硝唑在体外敏感试验没有标准。 （十一）厌氧细菌的药敏试验 由于大多数用于厌氧细菌感染的药物对临床有很好的预期效果，所以并不推荐做常规的厌氧菌药敏试验,但在严重厌氧菌感染而常规治疗疗效差的情况下有必要测定 致病菌的MIC值,指导用药;在新药评价时需要做厌氧菌的药敏试验,用MIC值评价药效学。随着厌氧细菌感染率的增长，厌氧细菌的耐药性也在不断增长，特别是脆弱拟杆菌已有报道对亚胺培南和甲硝唑的耐药株报道，几乎所有的脆弱拟杆菌均产生-内酰胺酶，部分菌株产生超广谱-内酰胺酶。越来越多的梭杆菌产生-内酰胺酶导致对-内酰胺酶抗生素耐药。（十二）真菌的药敏试验 由于真菌药物敏感试验影响因素颇多，如真菌生长的速度、药物在体内的代谢、培养条件等，所以真菌药敏试验结果与疗效的一致性至今是本领域需要探讨的重要课题 。1.酵母样真菌药敏试验 （1）酵母样真菌的药敏折点 1992年，NCCLS起草了酵母菌的液体稀释法抗真菌药物敏感试验参考方案文件名称为M-27P，用于检测引起深部感染的酵母样真菌，包括念珠菌、光滑球似酵母和新生隐球菌等菌对两新霉素-B（AmB）、5-氟胞嘧啶（5-FC）、氟康唑（FCZ）、伊曲康唑（ICZ）等的敏感性；1995年NCCLS对该草案作了修正，增加了微量稀释法起名为（M-27T）；1995-1997年NCCLS对终点判断方法进行了修定，形成了酵母菌稀释法抗真菌药敏试验实施方案（M-27A）；2002年NCCLS统一了微量稀释法中24h和48h终点判断方法，增加了新的抗真菌泊沙抗唑（posaconazole）、雷夫康唑（ravuconazole）和伏力康唑（vuliconazole VCZ）的试验方法和MIC参照范围，并将该方案修定出版，名为M-27A2。 （2）CLSI对酵母样真菌现有的标准 药物名称 SSDDIRFCZ816-32-64ICZ0.1250.25-0.5-15-FC4-8-1632AmB-VCZ1-24（3）CLSI对酵母样真菌纸片法判断标准敏感性FCZVCZS1917SDD15-1814-16R14132. 丝状真菌药敏试验 （1）丝状真菌的药敏折点：初始方案产生于1998年，命名为M-38P，该方案包括微量稀释法和洪量稀释法，对曲霉菌、镰刀菌、波氏假阿利什曼等丝状真菌有较好的一致性；2003年NCCLS对某些最低抑菌浓度（MIC）判定方法及影响因素作了多中心的研究和修正，并增加了新三唑类药物的试验方案，从此产生了现在用于实验室药敏试验和新药评价的常规方法M-38A。 （2）丝状真菌药敏报告：CLSI颁布的M-38P是丝状真菌肉汤稀释法抗真菌药敏试验,内容并无丝状真菌敏感性折点，只是描述了测试方案，包括试剂配制、操作方法、质量控制等程序。3关于真菌药敏报告 （1）Candida.Krusel(克柔假丝酵母)对氟康唑天然耐药,现已颁布的氟康唑对念珠菌的判断标准不适用，不管体外药敏结果均应报告耐药。（2）AMB对念珠菌目前无判断标准。（3）伊曲康唑的折点仅适用于黏膜念珠菌感染,对侵袭性感染时全身性用药并不适用，建议仅报告MIC不报告S、I和R。（4）对5-FC现有的标准是基于联合用药情况下的敏感折点，如单独用药，该标准不适用。（5）卡泊芬净至今无体内外相关性好和重见性稳定的药敏试验方法，至今无评定标准，但有报道可用MEC，即最低有效浓度（能使真菌形态发生改变的最低药物浓度），用于评价药物的有效性。4E-test方法适合哪些真菌的药敏试验E-test方法可适合多种真菌的药敏测试，包括酵母样真菌，如念珠菌、隐球菌状真菌，如曲霉菌、镰刀菌、毛霉菌、根霉菌、梨头霉、外瓶霉、帚霉等的药敏测试。5.正确报告FUNGUS-3的规范方法（1）FUNGUS-3试条中氟胞嘧啶只有2个稀释浓度，一个高浓度，一个低浓度，报告以敏感度报告；（2）当两个浓度均有菌生长,并生长超过80%,报告耐药“R”。（3）当高浓度真菌被抑制80%或以上,低浓度孔真菌完全生长或生长80%报告“SDD”。（4）当两个浓度均无真菌生长报告敏感“S”。（5）可通过肉眼判读或是使用ATB仪器自动判读来观察生长情况：肉眼判读前，建议把试条放在黑暗的背景下（可从bioMerieux得到ATB FUNGUS 3可视化判读器）。对于每一个抗真菌制剂，从低浓度开始，与生长对照比较，在结果记录纸上记下每一个杯的生长得分。（6）正确报告FUNGUS-3的药敏结果的方法：对于两性霉素B，最小抑菌浓度（MIC）是生长完全被抑制的测试杯的浓度（得分为“0”的测试杯）；对于氟康唑（FCA）, 伊曲康唑（ITR）和 伏立康唑（VRC），鉴于可能存在拖尾生长，最小抑菌浓度（MIC） 对应的测试杯得分可以是生长得分为“2”，“1”，或是“0”分。需要注意的是：在杯状凹外围的生长迹象应记录为“0”或“1”分。 例ATB FUNGUS 2如下图三.MIC在真菌感染临床治疗中的指导意义 在临床应用中，按日剂量与MIC比值大于50的剂量用于严重真菌感染，日剂量与MIC值比值为25的剂量用于一般真菌感染的原则被应用。也有文献提示，临床实践证明当抗真菌药物MIC值大于2ug时，疗效差，死亡率高。含MIC的真菌药敏报告对临床治疗更有价值。（一）抗真菌药敏试验与临床的相关性ICZ法中MIC0.125ug/ml敏感，0.25-0.5ug/ml剂量依赖敏感，1.0ug/ml为耐药。如给药400mg/d,MIC1.56ug/ml为耐药； MCZ治疗泌尿系统白念感染，如耐药，其MIC可上升100倍；KCZ治疗CMCC，白念如果耐药，对其他唑类可交叉耐药。5-FC耐药的MIC为32ug/ml，敏感值为4ug/ml；AmB试验耐药菌株有白念、热带、葡萄牙念珠菌，MIC大于0.8ug/ml可以死亡，NCCLS法不太适合。但耐药一般为1.0ug/ml。FCZ试验中一般剂量依赖耐药为16-32ug/ml，但64ug/ml即为耐药。也可以说，组织药物浓度的测定是联系药敏试验和临床用药的桥梁。以FLC为例：剂 量 组织浓度 100mg/d6g/ml400mg/d20-30g/ml800mg/d40-60g/mlRex JH, Clin Microb Rev 1993, 6: 367-381（二）体外抗真菌药敏试验与体内疗效的一致性NCCLS M27-A试验研究中：600余株念珠菌MIC值，分离自150余例AIDS的食管念珠菌病，一致性好；治疗失败者，MIC值大于64 g/ml，并显示MIC值与临床疗效 成90-60原则，即：药敏试验敏感菌株：90%对治疗有效；药敏试验耐药菌株：60%对治疗有效（Mahmoud A.G, JCM 1996, 34:489-495；Rex J,CID 2002, 35: 982-989）。体外抗真菌药敏试验指导用药，以FLC为例：MIC 剂量 4g/ml100mg/d4-8g/ml200mg/d8-16g/ml400mg/d16-32g/ml800mg/dHopenthal et al, Diagn Microb Infect Dis, 2004, 48:153-160（三） 真菌药敏试验的应用原则当疾病为孤立的粘膜念珠菌病时，建议经验性治疗，不做药敏；当为复发的粘膜念珠菌病时，建议菌种鉴定，如果治疗失败应该考虑到药敏；当高危患者中念珠菌定植时，建议菌