疟原虫的镜检技术ppt课件

疟原虫镜检技术培训,2015年传染病涉及的文件,1 中国腹泻病诊断治疗方案 2 山东省霍乱监测方案 3霍乱防治手册（第6版） 4细菌性和阿米巴痢疾诊断标准,2015年传染病实验室总要求,以霍乱、手足口病、流感、人禽流感、流行性出血热、布病、发热伴血小板减少综合征、碘缺乏病、疟疾为主 以霍乱为重点的传染病、依托腹泻病门诊发现霍乱、伤寒、副伤寒、菌痢、O157H7大肠杆菌和其他腹泻病例，包括副溶血弧菌 空肠弯曲菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌等病原菌 逢泻必检 逢疑必检 检测率不低于30%，分离培养率必须达到10% 二级以及以上医疗单位每年至少分离5株肠道致病菌,截至2014年12月，辖区11个检测点应检血片7125张，复检1316张（2张阳性）.1-12月各检测点复检疟原虫血片总计如下,千佛山医院 164 齐鲁花园医院 94 历下三院 112 安康医院 94 市立一院 146 历下医院 144 省中医 156 二钢医院 45 武警医院 137 齐鲁医院 120 中心医院 19,主要内容,疟疾的危害和主要防治经历 疟疾快速诊断试剂盒简介。 厚薄血膜的制作与染色。 疟原虫人体内生活史简介。 厚薄血膜疟原虫形态结构特点。,疟疾的危害,疟疾是古老的地方性传染病：在4,000年前我国已有疟疾流行。 疟疾流行于热带、亚热带及温带边缘地区，是重要蚊媒传染病，现有107个国家，约32亿人口受到疟疾传播的威胁，尤其是非洲最为厉害， 建国前后我国每年至少有3,000万疟疾患者，病死率约为1。 山东省年发病人数60年代初和70年代初曾分别高达600万和400万；鲁南、鲁西南的许多县(市、区）发病率达40%50%，一些村队发病率高达80%以上。,疟疾的危害,疟疾为全球危害最为严重的三大公共卫生疾病（艾滋病、结核、疟疾）之一 政府的疟疾日 2000年起，每年4月25日为非洲疟疾日。 考虑疟疾的严重危害，WHO在2007年5月世界卫生大会又将该日定为世界疟疾日，旨在推动全球进行疟疾防治。2008年4月25日为首个世界疟疾日。 卫生部结合我国实际情况，决定将每年4月26日作为“全国疟疾日”。,我国长期防治经历和成效,我国防治工作历程 19491959年：重点调查及防治试点研究阶段 19601979年：大力防治、控制流行阶段 19801999年：降低发病率阶段 2000年后：巩固防治成果阶段 从控制走向消除 目前，在全国2858个县（市、区）中，97.38%的县（市、区）连续3年的发病率已降至1/万以下或无当地感染病例，标志着我国的疟疾防治已由控制进入消除。,疟疾的实验室诊断,1.病原学诊断：显微镜血涂片检查结果阳性；这种镜检确诊最可靠。 2.免疫学诊断：（1）循环抗原的检测 （2）循环抗体的检测 3.分子生物学技术：PCR和DNA探针已应用与疟疾的诊断。 分子生物学、血清学技术发展迅猛，但是确诊疟疾的“金标准” 仍然是病原学诊断显微镜检查疟原虫。 快速诊断试纸条可与镜检疟原虫相互补充。,OptiMAL IT卡疟疾快速诊断试剂盒,OptiMAL IT卡疟疾快速诊断 试剂盒使用说明书,4.将吸血后的毛细管竖立于凹槽2中，捏出全部血液并与凹槽中稀释液混匀约1分钟。,生产公司：深圳市康百得生物科技有限公司； 价格：45元/人份，包装：24人份/最小包装； 保质期：6个月。,血膜的制作（取血时间）,采血时间 现症病人和流调普查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。 疟疾典型的临床表现分前驱期、发冷（寒战）期、发热期、出汗期和间歇期五期。 间日疟在前驱期相当于肝内期疟原虫发育，因原虫密度太低，镜检多为阴性。发冷（寒战）期相当于红内期成熟裂殖体涨破红细胞期，镜检多为裂殖体和环状体。 发热期，外周血中以环状体（小滋养体）为主，也可见到裂殖体；出汗期因原虫密度太低，镜检多为阴性。发作后数小时（h），间歇期外周血中以大滋养体为主，形态较易辩认，为诊断的有利时机；发作36-48h，可检出裂殖体；发作1-2次后，配子体出现较多。 恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20h内取血，初发患者退热后常查不到原虫。 末梢血血检到恶性疟原虫配子体，是在末梢血出现环状体之后的10天左右。,取血部位和血量,采血部位和取血方法： 核对编号、信息 耳垂或无名指（婴幼儿母趾或足跟），通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒大米（即火柴头）大小。 取血方法有小技巧,血膜的制作 用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂呈薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘，称厚血膜。无特殊要求的可厚薄血膜分载玻片涂制。,发热病人血片,标本片,血膜的制作（涂片操作）,涂制厚、薄血膜的位置 通常将厚、薄血膜涂在一张载玻片上。方法是将载片分为6等分，第1、2格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部。作为标本的血片每张玻片涂厚、薄血膜各1个；门诊和发热病人血片每片1人， 涂2个厚血膜1个薄血膜， 以防血膜脱落而影响检查；,标本片,发热病人血片,标签,薄血膜的制作,薄血膜 用推片一端边缘的中点从取血部分取约11.5微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，并形成25350夹角，待血液向两侧扩展约 2cm2.5cm宽时，均匀而迅速地从右向左推成舌状薄血膜（约2.5cm长）。推制时速度要均匀，血滴大小、推片与载玻片之间夹角大小及展开血膜的速度快慢等常影响血膜的厚薄。制成的薄血膜应在玻片上形成平铺的血细胞，细胞之间互相接触而不相互重叠。薄血膜外观：舌状厚薄均匀，无划痕，位于玻片1/21/3处【左半部分（或第46份）】 。,熟练工作者的推片姿势,厚血膜的制作,厚血膜 用推片的左下角，从取血部位刮取约45微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转24圈，涂成直径0.81cm大小圆形厚血膜(厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到510个白细胞为宜)，厚血膜的位置，位于玻片右1/3处。厚血膜外观：圆形厚薄均匀，无划痕。过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求，以油镜视野5-10个WBC为宜。,标准的疟疾厚薄血膜位置,各种不同的疟疾血片涂制法,标准血片（1人）,门诊发热病人血片（1人）,居民普查血片（2人）,血膜的制作,血膜编号 血膜制成后，立即在玻片面上写上受检者的号码，以防差错，依次顺序插入标本盒内。,染液的种类,染液种类：疟原虫的染色，目前临床上应用最广泛的是瑞氏（Wright stain）和吉氏染液（Giemsa stain）。这些染液中的主要染剂都包含美蓝、伊红和由美蓝氧化所成的天青，所以称多色性染剂。 我们主要用吉氏染液，它具有方便，染色效果稳定，便于长期保存的优点。瑞氏染色，染色时间短，但染色效果不如吉氏稳定，主要在门诊量大的门诊实验室使用。,染液的染色原理,染色原理是染料于被染物的阴阳离子互相吸附而结合的一种化学反应。 红、白细胞和疟原虫所含蛋白质的氨基酸电离出的阴阳离子与酸碱染料伊红、美蓝有色集团所带的阴阳离子相互结合便被染上不同的颜色。 疟原虫和白细胞的胞浆被染成蓝色，红细胞、疟原虫和白细胞核被染成紫红色。 红、白细胞和疟原虫的蛋白质均由氨基酸组成，每个氨基酸电离出一个带正电荷的-NH3+和一个带负电荷的-COO-。多色染剂的碱性染料美蓝的有色基团带阳离子，可与细胞中带负电荷的-COO-部分结合，使之成为蓝色。疟原虫、淋巴和大单核细胞的胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质，故被染成蓝色。酸性染料伊红的有色基团带阴离子，可与细胞中带正电荷的-NH2+部分结合，使之呈红色；但美蓝与伊红都不能使疟原虫和白细胞的核着色，可美蓝氧化后产生的天青有媒染作用，于是，在媒染物与染料的共同作用下，疟原虫和白细胞核被染成紫红色。,染液的种类及染色原理,注意：蛋白质和氨基酸都是两性电解质，要求染液的pH值7.0-7.2较好。 染液偏酸时，所带的正电荷增加，易于伊红结合，使红细胞和疟原虫的核染成鲜红色，而淋巴细胞和原虫的胞浆着色较差；反之，当染液偏碱时，红细胞和嗜伊红白细胞的颗粒等被染成紫蓝色，不易观察。,姬氏染液母液配置方法,取姬氏粉0.5克置于研钵中，加25ml甘油充分研磨，倒入60或100ml带有玻塞的有色玻瓶中。在研钵中加少量甲醇，洗去甘油浓液混入瓶内，至25ml甲醇洗净钵中甘油染液为止，塞紧瓶塞，充分摇匀，置于5560水浴中或温箱内24h或室温内35天，多加摇动，即成原液。姬氏染液是目前较优良的血膜染剂，即使在炎热天气中，亦可经久不变。 材料： 1、姬氏粉0.5克 2、甘油25ml 3、甲醇25ml 注意事项： 1.高纯度试剂。 2.所用器皿绝对无水（伊红在水溶液内遇到美蓝或天青即可互相化合而产生沉淀，从而失去染色力）。 3.边加边磨，充分研磨；整个染色液配制时间不能少于5个小时。,姬氏染液的染色方法,先用甲醇或无水酒精固定薄血膜,再用清水对厚血膜溶脱血红蛋白，然后再进行染色。 注意：吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色效果. 成批血片染色：将已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液稀释液（3毫升吉氏原液加缓冲液或净水97毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30min（根据当地实际情况，酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。 单张血片染色：将处理好的血膜，加姬氏母液1-2滴，加中性蒸馏水15-30滴，染色30分钟左右，然后用清水轻轻将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。 较理想的染色结果是红细胞为淡红或淡紫红色，疟原虫的胞质呈蓝色，核为紫红色，疟色素为棕褐色。,操作1 （快染） 配制5%染液，（每张血片约需染液2ml）：量筒内量2ml缓冲液或新鲜凉开水，直接滴加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色10min，清水细缓冲洗，晾干镜检。（一般配制5%-10%，染色时间短，一定掌握好时间。） 操作2 (慢染)配制3%染液：在染色量筒内量2ml蒸馏水或新鲜凉开水， 再滴加吉氏原液4滴，混匀，滴入待染标本上，染色3040min。清水细缓冲洗，晾干镜检。（一般配制2.5%-3%染液，染色效果稳定。）,吉氏染液浓度,门诊染色,影响染色效果的因素,（1）染剂、溶剂的质量 （2）染液的新旧 （3）染液稀释后使用时间 （4）染液的稀释浓度 （5）染色时间 （6）染色用水 （7）冲洗方法,血片制作与染色注意事项,使用前载玻片一定要清洁，否则会影响血片制作和镜检结果。 厚血膜干燥时勿加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果。 配置母液时过滤可除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量。 固定薄血膜时勿将甲醇触碰到厚血膜。 冲洗染液时，水流轻缓，勿冲走厚血膜。,1.在学习镜检疟原虫之前，必须先对正常厚薄血膜中各种血细胞的形态、内部结构和染色性质加以识别。 2.镜检疟原虫，首先学看薄血膜，在基本上掌握薄血膜中疟原虫形态后，再学习镜检厚血膜。 3.镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜仅作为原虫分类时参考和血片编号之用。 4.镜检疟原虫须用油镜头配合5X低倍目镜镜检，当发现疑难问题时再调换10X目镜进行观察。 5.检查时应从厚血膜的上缘开始，使血膜从上而下，自左至右，顺序地查完整个血膜。 一般情况下，厚血膜四周（稍薄些）疟原虫数量较多，且形态较清楚，镜检时不要忽略。每张厚血膜检查时间最少不低于20分钟。,血片的镜检,看完血片后，若为阳性，应立即按血片编号登记原虫的种、期，以防差错。为检查后记录结果方便起见，对疟原虫的种、期可使用英文字母缩写作为代号： 间日疟： Pv (Plasmodium vivax) 恶性疟： Pf (Pfalciparum) 三日疟： Pm (Pmalarae) 卵形疟： Po (Povale) 环状体： R (Ring form) 大滋养体：T (trophozoite) 裂殖体： S (Schizont) 配子体： G (Gametocyte),如何确定疟原虫血片为阴性, 检查全部厚血膜未查见疟原虫。 最少检查100个厚血膜油镜视野未查见 疟原虫。 镜检时间最少不低于20分钟。,借助疟原虫生活史简图，复习一下红内各期原虫形态,生 活 史,含成熟疟原虫子孢子按蚊 叮咬人 子孢子随唾液进入人体血液 约30分钟 侵入肝细胞 裂体增殖 成熟裂殖体（含数以万计裂殖子） 肝细胞破裂 裂殖子侵入红细胞（开始红细胞内期发育） 发育 小滋养体（环状体） 摄食营养、发育 大滋养体 核分裂、发育 未成熟裂殖体 核进一步分裂 裂殖体（成熟） 被寄生红细胞破裂 裂殖子释放入血流 一部分被巨噬细胞吞噬。 一部分再侵入红细胞，开始新的一轮发育。 一部分裂殖子在红细胞内不再进行裂体增殖，而发育成雌，雄配 子体。在蚊体内进行有性生殖。 由生活史容易看出，疟原虫对人体的主要致病阶段是红 细胞内期的裂体增殖期；主要是指红细胞内期的无性体小 滋养体到成熟裂殖体，而不是红细胞内期的无性体配子体；可 具有流行病学意义的疟疾传染源为外周血内有配子体 的现症病人和带虫者，可见早期诊断治疗的重要性。复发由肝内期 迟发型子孢子引起。,人类四种疟原虫的基本特征,感染人的疟原虫有四种: 恶性疟原虫 P. falciparum 间日疟原虫 P. vivax 三日疟原虫 P. malariae 卵形疟原虫 P. ovale,恶性疟 P.falciparum, 四种疟原虫中致病力最强； 无免疫力者感染后出现急性症状， 不及时治疗可危及生命； 在我国主要流行于云南省和海南省。,间日疟 P.vivax, 间日疟原虫分布于我国大部分地区， 主要是中部地区。 引起间日疟，病程呈良性， 但有复发。,疟色素的形成,血红蛋白消化 ,珠蛋白氨基酸合成原虫蛋白,血红素 高铁血红素疟色素,人体疟原虫的基本结构,疟原虫基本构造为细胞质（胞浆）、核和疟色素这三要素。 1.细胞浆 被染成蔚蓝色或深蓝色，随着虫体发育长大，细胞浆逐渐增多。 2.核 即细胞核或染色质粒，核染成鲜红色。 3.疟色素 不着色，颜色和颗粒的形状，因疟原虫种类而异。间日疟原虫黄褐色、型呈短棒状；恶性疟原虫黑褐色、型呈细砂状。,薄血膜中间日疟、恶性疟 各期疟原虫的形态结构特点,薄血膜中常见的血液成分,中性粒细胞,嗜酸性粒细胞,血小板,单核细胞,淋巴细胞,红细胞,薄血膜疟原虫形态,间日疟 环状体 感染的红细胞：胀大不明显，基本正常。 虫体大小：较大，约为红细胞直径1/3。 胞浆：环状，浅蓝色。 核：红色，一个，偶有二个。 疟色素：无。,约占寄生红细胞的1/3，很少见到一个红细胞寄生2个环状体和一个环状体有2个核。,薄血膜疟原虫形态,恶性疟环状体 感染的红细胞：大小正常,颜色较深。 虫体大小：较小，约为红细胞直径1/5-1/6。 胞浆：蓝色，环状纤细,有时位于红细胞的边缘。常见多个原虫同寄生于一红细胞的现象。 核：红色一个,常有二个。 疟色素：无。,恶性疟原虫-环状体,环纤细,约为RBC直径的1/6，RBC不胀大 核1个，但2个常见，红细胞常含2个以上原虫,薄血膜间日疟大滋养体形态,感染的红细胞：胀大褪色，出现形状大小相等、分布均匀、数目较多、鲜红色的薛氏小点。 虫体大小：较大。 胞浆：不规则，浅蓝色，出现阿米巴伪足，有空泡。 核： 红色，一个。 疟色素：有，细小杆状，黄褐色，分布不均匀。,间 日 疟 大 滋 养 体,虫体不规则，较大；阿米巴样空泡明显；疟色素细小，黄褐色。,间日疟大滋养体,恶性疟大滋养体,受感染红细胞：大小正常，颜色较深，可出现较粗、大小不一、分布不匀、数目较少红色茂氏小点。 虫体大小：较小。 胞浆：蓝色，圆形，坚实，体积小。 核：一个，红色。 疟色素：较细的黑褐色颗粒，常集成块。,恶性疟大滋养体,红细胞：胀大，褪色，可有薛氏小点。 胞浆：较不规则，空泡小或消失，浅蓝色。 核： 红色，分裂为二个以上。 色素：黄褐色，分布不均匀。,间日疟未成熟裂殖体,薄血膜疟原虫形态,间 日 疟 未 成 熟 裂 殖 体,恶性疟未成熟裂殖体,红细胞：大小正常，颜色较深，可有茂氏小点。 大小： 较小。 胞浆：规则，圆形或卵圆形，蓝色。 核：分裂为二个以上，红色。 色素：黄褐色颗粒，常集成黑褐色团块。,间日疟成熟裂殖体,红细胞：胀大，褪色，可见薛氏小点。 大小：个体较大。 胞浆和核：裂殖子1224个，通常为1618个，排列不规则，核红色，胞浆浅蓝色。 疟色素：黄褐色，常集于疟原虫的一边。,间日疟裂殖体,恶性疟成熟裂殖体,红细胞：大小正常，颜色 较深，可见茂氏小点。 大小：虫体较小。 胞浆和核：裂殖子832 个，通常为818个， 排列不规则，核红色，胞浆蓝色。 色素：黑褐色，集中于中央或一侧。,恶性疟成熟裂殖体,裂殖子832个，通常818个，排列不规则 疟色素集中成团块状 虫体占红细胞体积的2/3至3/4,薄血膜间日疟雌（大）配子体形态,形状大小：圆形或椭圆形，较大。 胞浆：深蓝色。 核：一个，较小，深红色，常偏于一边，核周可见明显不染色带。 疟色素：黄褐色，均匀散在，数目较多。,间日疟原虫雌配子体,间日疟雄（小）配子体形态,形状大小：圆形，虫体较大。 胞浆：浅蓝色。 核：一个，较大，疏松，位于中央，浅红色，周围有明显不着色带。 疟色素：黄褐色，散在分布。,间日疟原虫雄配子体,恶性疟雌（大）配子体形态,形状：新月形，两端稍尖。 胞浆：深蓝色。 核：一个，较小，致密，深红色，位于中央，核周可见透明不染色带。 疟色素：黑褐色，密布于核的周围。,薄血膜恶性疟雄（小）配子体形态,形状：腊肠形，两端钝圆。 胞浆：浅蓝色或淡紫红色。 核：一个，较大，疏松，位于中央，浅红色，核周可见不染色带。 疟色素：黑褐色，松散分布于核周围。,将（未）成熟雌配子体与成熟大滋养体 (核分裂前，刚要进入裂殖体前期)的形态鉴别,虫体大小:几乎充满被寄生的红细胞 核:一个，较大且致密，周围有一圈空白的不染色带 胞浆:边缘清楚，不含空泡 疟色素:颗粒较多较粗，均匀散在,虫体大小:不超过被寄生红细胞的3/4 核:一个，延长呈带状，周围无明显的不染色带 胞浆:边缘不整齐，多有空泡 疟色素:颗粒较少较细，分布不均匀,厚血膜中间日疟、恶性疟 各期疟原虫的形态结构特点,厚血膜中疟原虫的形态,厚血膜由于用血量较多，涂制的血膜小，红细胞重叠且干燥慢，致使虫体皱缩，空泡消失，胞浆变形，各期疟原虫的体积都略微缩小，其中只有大、小滋养体的形态有较大改变，而裂殖体和配子体的形态则无明显变化。,INTITUTEOFTROPICALDISEAASESHAINAN,厚血膜环状体形态,环状体： 胞浆呈环状或向核的一侧或两侧收缩，使环的中间断裂，或围绕核。间日疟原虫的环较大，常呈分号“；”和感叹号“！”状；恶性疟原虫的环纤细，常呈冒号“：”、飞鸟“.”、V状和断环状。,间日疟小滋养体,恶性疟小滋养体,厚血膜间日疟大滋养体形态,间日疟大滋养体呈阿米巴样运动，胞浆常断裂几块或缩成圆形，核和疟色素均被包在胞浆之中，着色深，只隐约可见红色的核和黄绿色的疟色素。胞浆可皱缩断裂成几个块状，大小不一，似互不连接。核位于胞浆之中或外边。疟色素分布不均匀。有些仅见胞浆和疟色素而核看不清楚。,大滋养体,厚血膜恶性疟 大滋养体形态,恶性疟原虫大滋养体与薄血膜形态相似，常呈圆形，体小结实，疟色素细小，金黄色，结成块状后，呈黑褐色。,大滋养体,厚血膜裂殖体形态,裂殖体 间日疟原虫、恶性疟原虫的裂殖体前期及成熟裂殖体，除虫体略微缩小着色较深外，均与薄血膜相似。,间日疟裂殖体,恶性疟裂殖体,厚血膜间日疟配子体形态,间日疟原虫的配子体呈圆形或卵圆形，除虫体略缩小且着色深外，均与薄血膜相似。雄配子体核大，疏松，圆形或呈星状，胞浆较少，着色淡，疟色素颗粒大，数量较多，散在分布。 雌配子体与圆形成熟的大滋养体相似，但配子体疟色素颗粒粗大，多而散在分布。,大配子体,小配子体,厚血膜恶性疟配子体 形态,配子体呈新月形或腊肠形，如血膜干燥较慢，则可缩成圆形，核居中，疟色素围在核周，外围一圈胞浆。此外，还可见配子体的胞浆部分或全部消失，只留下核和疟色素，或核和胞浆均消失，只留下一些疟色素。,大配子体,小配子体,厚薄血膜的优缺点及适用范围,薄血膜：用血量少1-1.5ul，疟原虫的形态完整，便于疟原虫虫种的鉴定。为保证检测的敏感性，常耗时较多，不适用于大规模调查；常出现漏诊。 厚血膜：用血量较多4-5ul，疟原虫胞浆和核有一定程度的固缩，较难识别；但须查范围小，节省时间，阳性检出率较高。,红细胞通常胀大 薛氏点明显 成熟环状体粗大 滋养体有阿米巴样伪足 可见不同发育期的原虫,间