生物化学4ppt课件

生物化学,Biochemistry,安徽中医药高等专科学校,吴 剑,第二章 蛋白质化学,第一节 蛋白质的化学组成,第二节 蛋白质的分子结构,一级结构,蛋白质的结构层次,四级结构,二级结构,三级结构,氨基酸,-螺旋,-折叠,氢键,转角,4.无规卷曲（random coil）,(三) 蛋白质的三级结构,(四) 蛋白质的四级结构,第三节 蛋白质的重要理化性质,一 、蛋白质两性电离和等电点,蛋白质的电泳,二 、 蛋白质的亲水胶体性质,三 、 蛋白质的变性,在某些物理和化学因素作用下，蛋白质三维构象被破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。变性的本质是次级键的破坏（包括二硫键），不改变蛋白质的一级结构。,(一)蛋白质变性的本质及特点,导致蛋白质变性的因素,物理因素：加热、高压、剧烈搅拌、超声波、紫外照射等 化学因素：酸、碱、有机溶剂（苯酚、乙醚等）、变性剂（尿素、盐酸胍等）、去垢剂（SDS ：十二烷基硫酸钠）、重金属盐等,蛋白质复性(renaturation),变性时间短、变性程度轻的情况下，在适合条件下蛋白在去除变性因素后可重新恢复到天然构象，恢复其生物活性，这种现象称为蛋白质的复性。,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,核糖核酸酶,生物活性丧失。 理化性质变化：溶解度下降或易于沉淀。 变性使得埋藏在分子内部的侧链基团暴露 出来，易被蛋白酶水解。,变性蛋白质的特性,(二)蛋白质变性理论在实践中的应用,应用 防止变性 杀菌消毒 变性与别构,四 蛋白质的颜色反应和紫外吸收光谱,(一)双缩脲反应,2H2NC NH2,H2NCNCNH2NH3,1320C,O,O,H,O,尿素,双缩脲,双缩脲,CuSO4+NaOH,紫红色物质,双缩脲反应:碱性环境,H2O O=C C=O HN NH R-CH CH-R O=C Cu C=O HN NH R-CH CH-R H2O 紫色络合物,(二)酚试剂反应,由磷钼酸和磷钨酸，硫酸，溴等组成。 此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。 本法可测定范围是25250ug蛋白质。,(三)蛋白质紫外吸收,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。,280nm,275nm,257nm,第四节 蛋白质的分离和纯化,一、根据蛋白质溶解度不同的分离方法 （一）蛋白质的盐析 蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，其溶解度降低并从溶液中析出的现象称为盐析。,蛋白质的盐析,硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响,离子强度,盐 析,盐溶,原 理：破坏水化膜、中和电荷 特 点：蛋白质不变性 分段盐析：不同浓度的中性盐分离不同蛋白质 不同蛋白质的分子结构，分子颗粒大小、pI、表面电荷的多少均不同。 在pI蛋白质的盐析效果最好。 常用中性盐：硫酸铵等,蛋白质在等电点的溶解度最小,pH与盐浓度对蛋白质溶解度的共同作用,(二)低温有机溶剂沉淀法,原理：破坏水化膜 条件：pH=pI 优点：分辨力高，溶剂易去除 缺点：易引起蛋白质变性，常在低温下进行 常用有机溶剂：乙醇、丙酮等能与水混溶的有机溶剂,(三)聚乙二醇沉淀法,原理：破坏水化膜 条件：pH=pI 特点：不需在低温下进行,二 根据蛋白质分子大小差别的分离方法,(一)透析和超滤,透析法：利用蛋白质分子不能透过半透膜(透析袋)的性质与小分子化合物分开的方法。,超滤法：应用一定的压力或离心力，使水和其他小的溶质分子通过超滤膜，而蛋白质被截留在超滤膜上，达到浓缩或分离蛋白质溶液的目的。,膜微观结构,(二)凝胶过滤,凝胶过滤又称排阻层析或分子筛层析 是根据各蛋白质分子大小不同分离 的方法。 凝胶是一种具有三维空间多孔的网状结构物质。,质谱仪,色谱法,利用吸附剂对不同有机物吸附作用的不同，分离、提纯有机物。,1906年，茨卫特在一根玻璃管的细端塞上一小团绵花，在管中充填碳酸钙粉末，让溶有绿色植物叶子色素的石油醚溶液自上而下地通过。结果植物色素便被碳酸钙吸附，分成三段不同颜色：绿色、黄色、黄绿色。再将碳酸钙吸附柱取出，并用乙醇洗脱，即得色素的溶液：叶绿素、叶黄素、胡萝卜素。,俄国植物学家茨卫特,色谱法归纳,依据物质的性质的不同，当流动相携带样品流经固定相时，样品中各组分就在两相间不断进行分配，最终达到分离与提纯,色谱法基本原理,与奥运会比较 让具有不同能力的人参与某种运动在运动中因为人的能力不同而显示出人与人的差异从而我们认识了王军霞、刘翔、姚明等 让具有不同性质的分子参与运动当中，在此过程中因为分子的性质决定了分子在特定条件下的能力从而显示出不同性质的分子之间的区别，从而我们可以分离分析分子。,柱 色 谱 法,吸附柱色谱法 分配柱色谱法 离子交换柱色谱法 凝胶柱色谱法,吸附柱色谱法：氧化铝 吸附机理：氧化铝吸附了外界的水分后在表面形成了铝羟基（AlOH）。 由于这些羟基的氢键作用而能吸附其他物质。,吸附柱色谱法,液-液分配柱色谱法,分离原理:连续萃取,液-液分配柱色谱法中的流动相是液体，固定相也是液体（又称固定液）。,固定相（液体）,载体（固体）,凝胶过滤的作用机制及凝胶微球,凝胶的种类和性质,(1)交联葡聚糖凝胶 (2)琼脂糖凝胶 依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。 (3)聚丙烯酰胺 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。 商品名为生物胶P (4) 聚丙乙烯凝胶 大网孔结构。,三 根据蛋白质带电性质进行分离,(一) 电泳法,不同的蛋白质在同一pH值条件下，因分子量、荷电性质及电荷数量不同，在电场中迁移率不同而将蛋白质分离的方法。,电泳法,等电聚焦电泳，利用两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止。,通电,(二)离子交换层析法,离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。,将阴离子交换树脂（本身带正电荷）颗粒填充在层析管内，当带负电荷的蛋白质(pHpI)就被吸引，但由于各种蛋白质所带电荷的种