[医学]第三节实验与应用.ppt

,第三节 实验技术及应用,讨论,实验步骤总结,配制溶液,溶液显色,测量,仪器调试,记录数据,数据处理,报告结果,一、样品的制备 样品在溶液中测定， 固体转换为溶液 溶剂要求：1.对被测组分有良好的溶解能力 2.在测定波长范围内没有吸收 3.被测组分在溶剂中有好的吸收 峰形 4.无毒，不易挥发，价格便宜,二、仪器测量条件的选择 1.波长选择 选最大吸收波长max为测定波长,选择原则：最强吸收带的最大吸收波长 作为测量波长 吸收峰太尖锐，可选用灵敏度低一些的波长测量，减少偏差,问题：如何绘制吸收曲线？,2.吸光度范围的选择 光源不稳定、读数不准确、实验条件偶然变动 测量误差 浓度较大或较小时，相对误差较大,选择A的测定范围为0.20.8,相对误差,问题：如果测定吸光度过大或过小应如何处理？,3.仪器狭缝宽度的选择 在不引起吸光度减小的情况下，选取最大的狭缝宽度,由专业人员来调节！,三、显色反应条件的选择,1.显色剂及其用量的选择,显色反应：将待测组分转化为有色物质 显色剂：与待测组分形成有色物质的试剂,a.显色剂的选择 要求：（1）与待测离子显色反应的产物组成恒定、稳定性好、显色条件易于控制； （2）产物有较强的吸收能力，即大； （3）显色剂与产物的颜色对照性好，即吸收波长有明显的差别，一般要求 max 60nm。,b.显色剂用量的选择 方法：固定被测组分浓度和其他条件，然后加入不同量的显色剂，分别测定吸光度A；吸光度A与显色剂用量CR的关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。,CR,a,b,a,b,2.反应的pH （显色反应的重要条件 ）,显色剂为有机弱酸（或弱碱），介质酸度直接影响其解离程度，从而影响显色反应的完全程度。 同种金属离子与同种显色剂反应，可以生成不同配位数的不同颜色的配合物，如Fe3+与水杨酸在不同pH条件下的配合物,pH对显色反应的影响：,确定pH的方法：固定溶液中待测组分和显色剂浓度，改变溶液(缓冲溶液控制)的酸度(pH) 绘制ApH曲线，从中找出平坦部分为pH范围。,a,b,显色（发色）时间：显色反应完成所需时间 稳定时间：显色后有色物质色泽保持稳定时间,3. 显色的时间,a、大多数显色反应是在常温下进行的，有些反应必须在较高温度下。,b、 绘制工作曲线和进行样品测定时应该使溶液温度保持一致。,4.显色温度,问题,在用邻二氮菲测定铁含量时,操作如下: 往铁标准溶液中依次加入:盐酸羟胺溶液，摇匀后再分别加入2ml 1.5g/l 邻二氮菲，5ml 醋酸钠溶液，用蒸馏水稀释至标线，摇匀.,请问:加入邻二氮菲、盐酸羟胺、醋酸钠溶液的作用分别是什么?,讨论,在铁标准液和试液中加入邻二氮菲溶液、盐酸羟胺溶液与醋酸钠溶液的作用是什么？,1、邻二氮菲的作用,(1)选择性好,(2)灵敏度高,选择显色反应考虑的因素,(3)生成有色化合物组成恒定,化学性质稳定,(4)对比度60nm,(5)显色条件下易于控制,可见分光光度法：利用测量有色物质对某一单色光吸收程度来进行测定的。,显色条件,讨论,2、盐酸羟胺与醋酸钠的作用,盐酸羟胺的作用是将溶液中的Fe3+还原成可与邻二氮菲反应的Fe2+ ，便于测定溶液中总铁含量。,醋酸钠溶液的作用是作为缓冲剂，调节溶液合适的pH，以保持邻二氮菲显色剂的稳定性。,小 节,1.波长选择 2.吸光度范围的选择 3.狭缝宽度的选择 4.显色剂及用量的选择 5.溶液pH的选择,方法相同：均取曲线平坦处,专业人员调节,0.2-0.8,最大吸收波长,四、参比溶液的选择,参比溶液的类型： 1.溶剂参比 试样溶液组成简单，其他组分很少且对测定波长光几乎无吸收，显色剂没有吸收，采用溶剂最为参比溶液。 2.试剂参比 显色剂或其他试剂在测定波长有吸收，按显色反应相同的条件，只是不加入试样溶液，同样加入试剂和溶剂作为参比溶液。,为什么需要使用参比溶液？ 消除溶液中其他成分以及吸收池和溶剂对光的反射和吸收带来的误差，使测得的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。,3.样品参比 试样基体溶液在测定波长有吸收，且与显色剂不起显色反应，按与显色反应相同的条件处理参比，只是不加显色剂。 4.褪色参比 显色剂、样品基体都有吸收，可以在显色剂中加入褪色剂选择性的与被测离子反应生成无色配合物（不含被测组分）,主要的几种干扰情况： 1. 共存离子本身有颜色：Fe3+、Cu2+ 2.干扰物质与显色剂或被测组分形成更稳定的配合物，使显色反应不能进行完全 3.干扰物质与显色剂形成有色化合物，在测定条件下有吸收,五、干扰及消除方法,消除方法,1.控制酸度 控制酸度使待测离子显色，而干扰离子不生成有色化合物。 如：磺基水杨酸测定Fe3+时，若Cu2+共存，此时Cu2+也能与磺基水杨酸形成黄色配合物而干扰测定。若溶液酸度控制在pH=2.5，此时铁能与磺基水杨酸形成配合物，而铜就不能。,2.选择适当的掩蔽剂 选择掩蔽剂的原则是： 掩蔽剂不与待测组分反应； 掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。 3.选择适当的测量波长 4.分离,紫外-可见分光光度法的应用,紫外-可见分光光度法可用于有机化合物的定性鉴定、结构推断和纯度检验。 1.未知化合物的定性鉴定 定性依据：吸收光谱的形状、吸收峰位置、摩尔吸光系数。 方法：相同条件下，测定未知物和已知标准物的吸收光谱，对比图谱。 目前最常用的标准图谱：萨特勒标准图谱库,一、定性分析,2. 有机化合物结构推断,有机物不少基团(生色团)，如羰基、苯环、硝基、共轭体系等，都有其特征的紫外或可见吸收带，某些特征基团的判别,例如：在204nm附近有中强吸收带，在260nm附近有弱吸收带且有精细结构，是苯环的特征吸收,3.化合物纯度检验,化合物在紫外区没有明显的吸收峰，而杂质在紫外区有较强的吸收，就可以紫外吸收曲线检测出该化合物所含的杂质。,如乙醇中杂质苯测定,二、定量分析,定量分析,可见分光光度定量分析,紫外分光光度定量分析,用于有色物质的测定,用于有紫外吸收的物质的测定,单组分的定量分析,A.吸光系数法 方法：已知待测组分吸光系数，测定溶液吸光度，代入朗伯-比尔定律公式计算含量。,A = k b c,单组分的定量分析：只要求测定某一个样品中一种组分，且在选定的测量波长下，其他组分没有吸收即对该组分不干扰。,B.标准对照法,浓度已知标液Cs，在一定条件下测得吸光度As 待测液Cx （浓度相近），在相同条件下测得吸光度为Ax 根据朗伯-比尔定律： As=kbcs Ax=kbcx cx =（Ax/As）cs 引起误差的偶然因素较多! 不可靠！,C.标准曲线法 方法：1.配制一系列不同浓度的标准溶液，以不含被测组分空白为参比溶液，测定标准系列溶液吸光度，以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程A=a+bC。 2.在相同条件下测定样品溶液的吸光度，从上述标准曲线得出的回归方程计算出浓度。,例题,以邻二氮菲为显色剂，采用标准曲线法测定微量Fe2+，实验得到标准溶液和样品的吸光度数据（见下表），试确定样品的浓度。,解：以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制标准曲线，采用线性处理程序进行线性回归处理，得回归方程为：A=0.109105C+0.0073, 相关系数r2=0.9994 标准曲线符合要求，将待测溶液吸光度代入回归方程，的试样浓度为:,a，截距,b，斜率,相关系数，接近1线性好，0.999,Cx=(A-0.0073)/0.109105 =(0.712-0.0073 )/0.109105 6.5110-5 molL-1,请大家归纳总结可见分光光度法和紫外分光光度法的联系和区别。(定义、条件、仪器、应用),紫外与可见分光光度法比较,可见分光光度法,紫外分光光度法,定义,基于物质对可见光的吸收而对 物质进行定性和定量分析的一 类方法,基于物质对紫外光的吸收而对 物质进行定性和定量分析的一 类方法,有色溶液；显色剂；控制PH; 绘制吸收曲线,选择最大波长 减小干扰;合适的参比液,条件,绘制吸收曲线,选择最大波长； 合适的参比液,仪器,400-780nm,钨灯,玻璃吸收池