[医学]基因工程抗体.ppt

基因工程抗体,根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体等。,Genetic engineering antibody,单克隆抗体用于治疗存在的问题,1、单克隆抗体的特异性 由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严 格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应； 2、异种抗体反应 鼠源性单抗用于人体，导致异源性超敏反应,理想的抗体药物的性质,高特异性和高亲和力（Kd=1081010L/M） 对人没有免疫原性，不诱导机体对抗体的排斥反应 游离抗体不激活补体 一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能 细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行 大规模培养 抗体符合生物制品标准,问 题 异源蛋白导致产生抗抗体，影响靶向性和效果 靶部位摄取的量太低 效应功能弱 在体内被清除速度快,对 策 抗体人源化 改变抗体分子大小 连接毒素、放射性同位素、药物 抗体人源化,抗体治疗存在的问题及对策,抗体药物改造的方向,抗体人源化和人源抗体制备 改变抗体分子大小 增强抗体亲和力 增强抗体效应功能,单克隆抗体人源化的改进,鼠抗体人源化（人-鼠嵌合、改型抗体） 小分子抗体（Fab、单链、单域、超变区多肽） 基因工程抗体（双特异、免疫黏连素、催化抗体） 人源抗体（噬菌体抗体库、转基因小鼠） 人-人抗体,1、抗体人源化 鼠单克隆抗体人源化 ：嵌合抗体、改型抗体 小分子抗体：单价(Fab、ScFv、单域抗体、 超变区多肽)、多价（Di-, Tri-, Minibody） 特殊类型抗体 (双特异性抗体、细胞内抗体、 抗原化抗体、免疫脂质体) 抗体融合蛋白 （免疫粘连素、免疫毒素、催 化抗体）,VH和VL是抗原决定簇结合位点 高变区 HVR 决定簇互补区CDR 骨架区FR CH1和CL：Ig同种异型的遗传标志 CH2：补体结合位点 CH3：某些细胞Fc受体结合部位,第一代的抗体人源化嵌合抗体 从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。嵌合抗体由于这两部分在空间结构上相对独立，其独特的抗体亲和力保持得很好，但因鼠单抗可变区的存在，应用时仍有较强的免疫排斥反应。 特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。,Pr 鼠VH 人 CH Pr 鼠VL 人 CL,免疫球蛋白 基因载体的构建,H链嵌合载体,L 链嵌合载体,共转染细胞,启动子,人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略,鼠VH,鼠V L,人CL,人CH,抗体分泌细胞,人-鼠嵌合基因工程抗体,第二代的抗体人源化改型抗体,在嵌合抗体的基础上进一步将鼠MAb可变区中相对保守的FR(framework region)替换成人的FR，保留与抗原结合部位决定簇互补区（complement determinant region)部位 (即CDR移植) 早期的改型抗体： 简单的CDR移植，通过点突变进行微调即更换某个位点上的氨基酸。,第二代改型抗体： 应用了人抗体基因库； 引进计算机技术模拟抗体分子的立体结构(分子模拟法)； 使用了鼠人嵌合FR。其目的是获得具有高亲和力的治疗性抗体,CDR序列,CDR序列,鼠单克隆抗体,人抗体,人源化抗体,鼠单克隆V区人源化（CDR移植）,小分子抗体 人源化抗体属完全的抗体分子。通过基因重组技术，可以在保持原有抗原结合活性的基础上，把完整的抗体分子改造成较小的分子，称为小分子抗体。 根据其价数的不同可分为单价小分子抗体及多价小分子抗体两种。,单价小分子抗体 一、Fab抗体 Fab段由重链V区及CH1功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。Fab抗体只有完整IgG的1/3。,二、单链抗体(ScFv) 定义：用基因工程方法， 将抗体VH和VL（重链和轻链可变区）通过一个连接肽连接而成的小分子抗体， 功能：具有较好的抗原结合能力，且分子量小、穿透力强、免疫原性低等特性。可与其他效应分子构建成多种具有新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体等的理想而基本的元件 。,ScFv应用： 用于肿瘤的导向治疗 肿瘤的影像分布 基因治疗 研究基因结构与功能的关系,三、单域抗体 抗体与抗原的结合主要由Ig的V区决定，因此只含V区基因片段的小分子抗体，即只有VH或 VL一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的特异性。这种小分子的抗体片段就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个Ig分子的112，故也称之为小抗体。,四.超变区多肽(hypervariable region polypeptides) 抗体抗原结合是经过补体决定区（CDR）来实现。因此，CDR是构成抗原抗体结合的最小结构单位。根据这一特点，可以设计出那些在抗原识别及亲和力方面有重要意义的CDR多肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的结果。这种只含有一个CDR多肽的抗体，称为超变区多肽，亦称为最小识别单位(minimal recognition unit, MRU)。,多价小分子抗体 在ScFv的基础上，可以把两个或两个以上的ScFv重组在一起，由此可制备成多价小分子抗体即微型抗体（简称多价微抗）。其中包括双链抗体(diabody)，微型抗体（minibody），三链抗体(triabody)及四链抗体(tetrabody)等。,一、双链抗体(diabody) 制备方法 化学交联法 粘性蛋白结构域融合法 接头长度控制法。,二、三链抗体(triabody) 在制备单链抗体时，当接头的长度为2个或2个的以下氨基酸残基时，或者直接把VH结构域的N末端与VL结构域的C末端相连，通过非共价键而形成的三聚体，称为三链抗体。接头长度在312个氨基酸残基时，则形成双链抗体。,三、微型抗体 (minibody),通过基因工程手段采用不同的接头把单链抗体(VL-VH)的VH结构域与IgG的CH3结构域融合，形成VL-VH-CH3的结构，称之为微型抗体（minibody）。 此种抗体合成后通过CH3结构域形成稳定二聚体式，发挥其双价微抗作用。,四、双特异性抗体（ BfAb ） 天然Ig是由两个完全相同的VL和VH区域构成，该区域是特异性识别并结合抗原的关键部位。而经人工设计构建的双特异性抗体（BsAb）则由两个不同的抗原结合位点组成，可同时与两种不同的抗原决定簇结合，并可将其偶连的药物、酶或放射性核素等导向到靶部位，这种具有双价双特异性的抗体又称为双功能抗体（bifunctional antibody,BfAb）,双特异性抗体的特点 将免疫细胞锚着于肿瘤部位，提高肿瘤部位的效靶比。 不受MHC的限制，直接激活免疫细胞的杀瘤机制。,1,2,3,提高抗体效应功能,抗体融合蛋白：抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的具有新的特性融合蛋白。 根据构建方式的不同，主要分为两种形式： Fc融合蛋白（Fc fusion protein,FcFP）由抗体的Fc 段与某些具有特定功能的蛋白结构域融合而成。如CD4免疫粘附素，就是由抗体的Fc段与2个CD4分子的Ig同源区重组而成 抗原结合融合蛋白（antigen-Binding fusion protein,ABFP）由具有抗原结合功能的抗体结构与其他功能性蛋白融合构成。如免疫毒素，抗体部分主要包括嵌合抗体、单链抗体形式。,免疫粘附素(immunoadhension) ：将人抗体恒定区(主要是Fc段)N-端连接于人细胞表面的受体分子或细胞粘附分子上，在真核细胞中表达出正确折叠的融合抗体蛋白分子，这种分子可同时发挥抗体的效应功能及其它相应的效应功能，这种分子又被称为新效能抗体。 免疫毒素：又称生物导弹，是由导向性的载体分子与具有毒性的弹头蛋白交联而制成，属于导向药物的一种。,偶连细胞毒物质,连接放射性同位素(131I、99mTc） 连接植物或细菌毒素（ricin、PE40） 连接细胞毒性药物（C1027、柔红霉素）,免疫毒素,C,C,V,C,V,C,C,C,SPDP,SPDP,Ricin A,Ricin A,（-FcRI-Ricin A）,Ricin A:蓖麻毒素A,对肿瘤细胞具有毒性作用,CH1,CH2,CH3,IL-2,scFv,IL-2,免疫细胞因子(Immunocytokine),五、细胞内抗体 细胞内抗体主要是指在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体，亦称内抗体（intrabody）。 目前的研究主要集中在单链抗体上，在ScFv的C端或N端插入其它靶向信号（targeting signals），如分泌信号、核定位信号、线粒体定位信号和内质网滞留信号等，从而进行检测、识别、发挥特定功能。,细胞内抗体的应用： 由于细胞内抗体具有高亲和力及选择结合特性，因而可通过多种机制调控细胞的生理过程及代谢。作用机理表现为： 阻断靶蛋白的活性部位 阻断细胞内蛋白蛋白相互作用 干扰细胞内靶蛋白的转运 促使靶蛋白降解,六、抗原化抗体（antigenized antibody, AbAg） AbAg是应用基因工程技术，把编码蛋白质抗原表位的核苷酸片段插入重链CDR3序列中进行表达，从而产生具有天然抗原表位构象和免疫原性的新型抗体。,今后抗体药物发展的方向,寻找新的靶抗原 基于抗原立体结构设计抗体 基于抗原-抗体相互作用设计小分子抗 体模拟物,最理想的单克隆抗体,100%人源 人类免疫系统自然产生,25年来的全人抗体的尝试,鼠骨髓瘤不适合与人B细胞融合 稳定性差 抗体产量低 非洲淋巴细胞瘤病毒 (EBV) 保存抗体分泌细胞 细胞株不稳定 抗体的产量低 不能特异性地保存抗体分泌细胞 很难获得人类骨髓瘤细胞株,成功建立人骨髓瘤细胞系，人源抗体