课件：第章蛋白质的结构与功能.ppt

蛋白质的结构与功能,第一章,Structure and Function of Protein,目的与要求 1、掌握:蛋白质的组成、氨基酸理化性质 2、掌握:蛋白质各级结构、维系结构的化学键 及结构与功能的关系 3、理解:蛋白质在生命过程的重要性；蛋白质的分类 4、运用蛋白质理化性质解释临床及生活现象,什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)连接形成的高分子含氮化合物。,proteins,生物催化,运动、支持,免疫防御,代谢调节,转运、贮存,控制生长和分化,信息接受和传递,组成生物膜,蛋白质的分子组成 The Molecular Component of Protein,第一节,一、蛋白质的元素组成,主要有C、H、O、N和S。 有些蛋白质含有少量磷、硒或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。,(一)组成蛋白质的元素,(二)蛋白质元素组成的特点,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16 。,100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数 6.25100,1/16%,C (5055%) H (67%) O (1924%) N (1319%) S (04%),三聚氰胺氮含量66.7%！,二、组成人体蛋白质的20种L-氨基酸,R,L-氨基酸的通式,碳原子,组成人体蛋白质的氨基酸都是L-氨基酸（甘氨酸例外）,组成蛋白质的氨基酸都是-氨基酸（脯氨酸例外）,非极性脂肪族氨基酸 极性中性氨基酸 芳香族氨基酸 酸性氨基酸 碱性氨基酸,二、氨基酸可根据侧链结构和理化性质进行分类,(一)侧链含烃链的氨基酸属于非极性脂肪族氨基酸,（亚氨基酸）,没有手性,(二)侧链有极性但不带电荷的氨基酸是极性中性氨基酸,白血病不能合成,解决氨的去路,变成SAM后使其他物质发生甲基化,含有羟基，容易被化学修饰,含有羟基，容易被化学修饰,构成GSH，还原其他物质，防止被氧化,(三)侧链含芳香基团的氨基酸是芳香族氨基酸,可转化成黑色素,可以合成维生素PP,(四)侧链含负性解离基团的氨基酸是酸性氨基酸,(五)侧链含正性解离基团的氨基酸属于碱性氨基酸,三、20种氨基酸具有共同或特异的理化性质,（一）氨基酸具有两性解离的性质,pH=pI,pHpI,pHpI,氨基酸的兼性离子,阳离子,阴离子,氨基酸的解离方式取决于其所处溶液的酸碱度,等电点 (isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，分子所带的净电荷为零, 呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,每个aa的pI是固定的，不随外界pH变化而变化，pH只影响aa的电荷性质和数量,（二）含共轭双键的氨基酸具有紫外吸收性质,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。,芳香族氨基酸的紫外吸收,由于大多数蛋白质含有酪氨酸和色氨酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法,肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,（一）氨基酸通过肽键连接而形成肽 (peptide),四、氨基酸通过肽键连接而形成蛋白质 或活性肽,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,氨基酸残基,Polypeptide chain,N端,C端,肽,Side-chain（侧链）,1.肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,2.两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,(二)肽(peptide),3.由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽。,4.肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,5.多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。分别有：,N 末端：多肽链中有自由氨基的一端， C 末端：多肽链中有自由羧基的一端。,重要的活性肽：Glutathione (GSH),H,Glu,Cys,Gly,Function of GSH,Antioxidant 2GSH + H2O2 GSSG + 2 H2O GSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP,蛋白质的分子结构 The Molecular Structure of Protein,第二节,蛋白质的分子结构包括:,一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure),定义: 蛋白质的一级结构指蛋白质分子从N-端至C-端的氨基酸排列顺序。,一、蛋白质的一级结构 （primary strcuture）,主要的化学键: 肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,Proinsulin,二、多肽链的局部主链构象为蛋白质 二级结构,主要的化学键：氢键,肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转。,参与肽键形成的6个原子在同一平面上,参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 (peptide unit) 。亦成为肽键平面,C是两个肽键平面的连接点,-螺旋 ( -helix) -折叠 (-pleated sheet) -转角 (-turn) 无规卷曲 (random coil),常见蛋白质二级结构类型,（二）-螺旋结构是常见的蛋白质二级结构,结构特点： 右手螺旋 每螺旋圈包含3.6个氨基酸残基，每个残基上升0.15nm，螺旋上升一圈0.54nm。 相邻螺旋之间通过肽键上的酰基氧与亚氨基氢形成氢键 氢键保持螺旋结构稳定。氢键方向与螺旋长轴基本平行。 氨基酸侧链伸向螺旋外侧，对-螺旋的形成有一定影响。,毛发角蛋白、肌球蛋白，原核生物DNA聚合酶I,一般螺旋中不出现脯氨酸，因为脯氨酸的氨基只有一个氢，形成肽键以后 没有多余的氢和第四个aa的羧基氧形成氢键稳定结构。 色氨酸有很大的侧链，吲哚基团太大，空间位阻大，若有几个色氨酸也不易形成螺旋。 同种电荷的aa不能同时出现在螺旋中。,（三）-折叠使多肽链形成片层结构,结构特点： 肽键平面折叠成锯齿状（折纸状）R基团交错位于齿状结构上下方 氢键维持稳定与主链长轴垂直 两条以上肽链并列时， -片层有顺式和反式平行 (4)R-基团太大时， -折叠不易形成,-折叠非常牢固 如：蜘蛛丝,-折叠,蚕丝蛋白几乎都是-折叠,N-端,N-端,N-端,C-端,N-端,C-端,（四）-转角和无规卷曲在蛋白质分子中普遍存在,-转角,结构特点： 转角常发生于肽链进行180回折时的转角上。 一转角通常由4个氨基酸残基组成,其第一个残基的羰基氧(O=C)与第四个残基的氨基氢(H)可形成氢键。 转角的第二个残基常为脯氨酸,其他常见残基有甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和色氨酸。,（五）模体是具有特殊功能的超二级结构。,在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个有规则的二级结构组合，被称为超二级结构。,模体常见的形式,模体(motif) 是蛋白质分子中具有特定空间构象和特定功能的结构成分。其中一类就是具有特殊功能的超二级结构,锌指结构（一个-螺旋 两个-折叠 三个肽段组成）,模体是具有特殊功能的超二级结构。,螺旋-环-螺旋,碱性亮氨酸拉链,模体不具备独立执行特定功能的能力，三级结构才具备独立执行某种功能的能力！,即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。,（一）三级结构是指整条多肽链中全部氨基酸残基 的相对空间位置,三、蛋白质的三级结构,由一条链构成的蛋白质，只有具有三级结构才能发挥生物学活性,分子量较大的蛋白质在形成三级结构时，肽链中某些局部的二级结构常常汇集在一起，形成发挥生物学功能的特定区域称为结构域 (domain) 。,一种蛋白质可包含多个结构域，一个结构域可由几个模体构成。 domain motif 每个结构域都是一个功能单位，具有独立的功能。 例如： 脂肪酸合成酶具有7个结构域，分别催化不同的反应。 DNA 结合蛋白至少含有两个结构域，DNA结合域和转录激活域。,（二）结构域是三级结构层次上的独立功能区,免疫球蛋白结构域示意图,亚基之间的结合主要是氢键、离子键、疏水作用。,四、含有二条以上多肽链的蛋白质具有四级结构,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基 (subunit)。,57,可编辑,1.具有四级结构的蛋白质，亚基单独存在，一般没有生物学功能，只有聚合成完整的四级结构才有生物学功能。 2.有些蛋白质虽然有两条或两条以上的肽链组成，但肽链间通过共价键（如二硫键等）相连，这种结构不属于四级结构的范畴，如胰岛素,注意！,由2个亚基组成的蛋白质四级结构中，若亚基分子结构相同，称之为同二聚体(homodimer)，若亚基分子结构不同，则称之为异二聚体(heterodimer)。,血红蛋白的四级结构,蛋白质结构与功能的关系 The Relation of Structure and Function of Protein,第三节,（一）一级结构是空间构象的基础,一、蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础,1、一级结构不同，功能不同,剩2-10,丧失活性,活性仍100,2. 一级结构中“关键”氨基酸消失，其功能也丧失,例：镰刀形红细胞贫血,3. 一级结构中“关键”改变，其生物学活性也改变,Sickle-cell anemia 镰刀型红细胞贫血,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”,Crescent-shaped erythrocytes,(lack of blood),The sickled cells are fragile. Their breakdown leads to an anemia that leaves the victim susceptible to infections and diseases.,The elongated cells tend to block capillaries, causing inflammation and considerable pain,镰刀型贫血症在非洲发病率较高,携带者(杂合体)表现为轻度贫血，但对恶性疟疾有较强的抵抗力，由于自然选择的结果，使这一基因在非洲恶性疟疾猖獗的地区较多保留了下来。,杂合体的红细胞,二、蛋白质的功能依赖特定空间结构,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,肌红蛋白/血红蛋白含有血红素辅基,血红素结构,（一）血红蛋白亚基与肌红蛋白结构相似,血红蛋白(hemoglobin，Hb),血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构，每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧。 Hb亚基之间通过8对盐键，使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。,（二）血红蛋白亚基构象变化可影响亚基与氧结合,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。,协同效应(cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 (positive cooperativity)。如果是抑制作用则称为负协同效应(negative cooperativity),（三）蛋白质构象改变可引起疾病,蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。 正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。 PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,疯牛病中的蛋白质构象改变,疯牛病(mad cow disease): 是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。表现为进行性痴呆、小脑共济失调、肌肉控制减弱、精神敏锐度下降、健忘和失眠等。又称海绵状脑病。具有传染性、遗传性或散在发病的特点。动物间的传播是由朊病毒蛋白（Prion protein, PrP）组成的传染性颗粒（不含核酸）完成的，是一种蛋白质感染因子，是一类能引起哺乳动物亚急性海绵样脑病的病原因子。,疯牛病中的蛋白质构象改变,病羊神经组织的海绵状损伤 图片来自,CJD病人大脑组织切片，左、海绵状病变及周围的沉淀斑，右、淀粉样蛋白沉淀，短线表示50um。引自Stanley B. Prusiner 1997,具有致病作用的是PrPSc蛋白（scrapie-associated prion protein） ，是一种结构变异的蛋白质，对高温和蛋白酶均具有较强的抵抗力,具有感染性。它能转变细胞内的此类正常的蛋白PrPC，使PrPC发生结构变异，变为具有致病作用的PrPSc。因此是一种蛋白质感染因子。,Prion的结构模型，左PrPc，右PrPSc 图片来自/cohen/media/pages/gallery.html,动物被感染后，发生错误折叠的PrPSc蛋白堆积在脑组织中，形成不溶的淀粉样蛋白沉淀，无法被蛋白酶分解，引起神经细胞凋亡(Apoptosis).,PrPc -螺旋,PrPsc -折叠,正常,疯牛病,PrPc与 PrPSc的比较,第四节,蛋白质的理化性质 The Physical and Chemical Characters of Protein,一、蛋白质具有两性电离的性质,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,蛋白质的等电点( isoelectric point, pI),二、蛋白质的高分子性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。 蛋白质具有胶体性质,颗粒表面电荷 水化膜,蛋白质胶体稳定的因素:,水化膜,带负电荷的蛋白质,溶液中蛋白质的聚沉,三、蛋白质空间结构破坏而引起变性,在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失称为蛋白质的变性。,蛋白质的变性(denaturation),造成变性的因素: 如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。,应用举例: 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。医用酒精（75%） 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,少数变性蛋白质去掉变形因素后，可自发的恢复原有的空间构象和生物学功能，称为蛋白质的复性(renaturation) 。,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,如：核糖核酸酶,蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 实际上凝固是蛋白质变性后进一步发展的不可逆的结果,蛋白质的凝固作用(protein coagulation),四、蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,五、蛋白质的呈色反应,(一) 茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。,(二) 双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,(三) Folin-酚试剂反应 蛋白质分子中酪氨酸残基在碱性条件下能与酚试剂反应生成蓝色化合物。该反应的灵敏度比双缩脲反应高100倍。,第五节,蛋白质的分离纯化与结构分析The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein,一、透析及超滤法可去除蛋白质溶液中的小分子化合物,应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,透析(dialysis),超滤法,利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,透析 (Dialysis),二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用的蛋白质沉淀方法,使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,三、利用荷电性质可用电泳法将蛋白质分离,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。 等电聚焦电泳，通