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发酵分析试验教案 试验一 酿造用水硬度分析（2学时）一、教学目的:掌握配位滴定法分析水硬度的操作技术。二、重点与难点:学习EDTA标准溶液的标定过程；掌握指示剂铬黑T的使用条件和终点变化三、主要内容:1.原理:水硬度主要是由水中钙盐、镁盐引起的，故硬度一般指水中钙离子、镁离子的浓度。水的硬度高就是指水中钙离子、镁离子浓度高。按钙、镁成盐形式不同，水的硬度分为碳酸盐硬度（又称暂时硬度）和非碳酸盐硬度（又称永久硬度）。水的硬度表示方法有好几种，常用的表示方法是以度为单位：1 L 水中含有钙、镁等盐的总量相当于10 mg CaO时，称为1度。按照硬度的大小，可将水质分为下列几类：水质的分类 Water Quality Class 名称(Name) 极软水(Very soft water) 软水(Soft water) 中等水(Moderately hard water) 硬水(Hard water) 极硬水(Very hard water) 硬度(Hardness) 04.2 4.28.4 8.416.8 16.828.0 28.0 EDTA(乙二胺四乙酸)其二钠盐可与水中钙离子、镁离子生成可溶性无色配合物,指示剂铬黑T也能与钙离子、镁离子配位,生成酒红色配合物。但EDTA与钙离子、镁离子的配合物更稳定。当在水样中加入蓝色的铬黑T后，生成铬黑T钙、镁配合物，而使溶液呈酒红色。再用EDTA滴定时，由于EDTA与钙离子、镁离子的配合能力强于铬黑T，故能将铬黑T钙、镁配合物中的钙离子、镁离子夺出来，进行配位，生成无色的EDTA钙、镁配合物，致使铬黑T游离出来，溶液从酒红色突变为蓝色，即为滴定终点。2.试剂：0.01mol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）标准滴定溶液：称取4g C10H14N2O8Na22H2O，用水加热溶解，冷却后用水定容至1000mL。a.标定:称取基准ZnO 1g（准确到0.0001g），用少量水润湿，加6mol/L的HCl溶液至样品溶解，移入250mL容量瓶中，用水稀释定容。移取该溶液25mL，加70mL水，用10%NH3H2O中和pH至7-8，加10mL pH10 NH4OH-NH4Cl缓冲液，加5滴1%铬黑T指示剂，用待标定的EDTA-Na2溶液滴定至溶液由紫色变为纯蓝色。同时做试剂空白试验。b.计算：c(C10H14N2O8Na22H2O)=m/0.08138(V1-V2) 式中：c(C10H14N2O8Na22H2O)：EDTA-Na2标准滴定溶液的实际浓度，mol/L； V1：滴定消耗EDTA-Na2标准滴定溶液的体积，mL； V2：空白试验消耗EDTA-Na2标准滴定溶液的体积，mL； m：ZnO的质量 0.08138:与1.00mL EDTA-Na2标准滴定溶液 c( EDTA) = 1.000mol/L相当的以克表示的氧化锌的质量。PH10 NH4OH-NH4Cl缓冲溶液：称取5.4g NH4Cl溶于水中，加35mL浓NH3H2O，用水稀释定容至100mL。1%铬黑T指示剂：称取1g铬黑T和1g盐酸羟胺，溶于100mL无水乙醇中。3.测定方法总硬度的测定：移取50mL水样，置于250mL三角瓶中，加5mL PH10 NH4OH-NH4Cl缓冲溶液和5滴1%铬黑T指示剂，用0.01mol/L EDTA-Na2标准滴定溶液滴定至蓝色。永久硬度的测定：移取50mL水样，置于250mL三角瓶中，煮沸10min，用滤纸过滤，滤液用250mL三角瓶接收，用水充分洗涤滤纸，使滤液接近50mL，加5mL PH10 NH4OH-NH4Cl缓冲溶液和5滴1%铬黑T指示剂，用0.01mol/L EDTA-Na2标准滴定溶液滴定至蓝色。4.计算总硬度=cV128.041/501/101000永久硬度=cV228.041/501/101000暂时硬度=总硬度-永久硬度C：EDTA-Na2标准滴定溶液的实际浓度，mol/L；V1：总硬度测定时消耗EDTA-Na2标准滴定溶液的体积，mL；V2：永久硬度测定时消耗EDTA-Na2标准滴定溶液的体积，mL；28.04: 与1.00mL EDTA-Na2标准滴定溶液 c( EDTA) = 1.000mol/L相当的以克表示的氧化钙的质量，mg。5.讨论滴定过程为什么要缓慢进行？如果铬黑T在水样中变白色或浑浊的玫瑰色，该怎么办？是什么原因引起的？ 试验二 Glu的制备（2学时）一、教学目的：学会由味精制备谷氨酸的方法,加深对谷氨酸发酵下游技术的认识。二、重点与难点：掌握酸碱滴定的操作步骤。三、主要内容：1.原理：谷氨酸与适量的碱发生中和反应生成L-谷氨酸一钠味精,味精与盐酸作用生成谷氨酸。2.实验材料与仪器：味精、浓HCl、烧杯、精密酸性PH试纸、纱布、玻棒、干燥箱。3.实验步骤(配50mL水中加35g味精）在烧杯中配制味精饱和溶液，然后缓慢加入一定量浓盐酸，边搅拌边检测溶液的PH值。当PH值3.0-3.2左右时,停止加浓盐酸，低温静止30min,谷氨酸沉淀出现。如果上清液比较少，考虑用纱布过滤后放进干燥箱干燥；如果上清液比较多，直接倒去部分上清或用纱布过滤后放进干燥箱干燥。（干燥一周左右后，称量固体粉末）4.实验结果:根据加入的味精质量和得到的谷氨酸的质量，计算出谷氨酸的大概得率。5.讨论：为什么要缓慢加浓盐酸？ 试验三 Glu的检测（2学时）一、教学目的：学会纸层析方法定性检测样品中氨基酸含量的操作步骤。二、重点与难点：掌握Rf值的计算方法。三、主要内容：1.原理：样品经纸层析分离、显色后，由于不同氨基酸色斑的Rf值不同,因此，可依据Rf值大小定性。样品中谷氨酸色斑与标准谷氨酸色斑的Rf值大小一致。2.实验材料与仪器：干燥箱，滤纸，针管，铅笔，直尺，一次性手套，正丁醇，冰醋酸，茚三酮。3.实验步骤： 配制展开剂：正丁醇:冰醋酸:水=5:3:2(V/V/V)(20-30mL)，展开剂中含有0.4%的茚三酮(W/V)。 层析纸的准备:裁取高度约为15cm的滤纸，宽度依样品数量而定，注意滤纸的纤维方向与长边一致。在距滤纸短边边线2cm处用铅笔画一直线，每隔1cm设一点样点，写上点样标记。 点样:用微量进样器将氨基酸标准液和处理好的待测谷氨酸样品（浓度2%）点在层析滤纸的相应点样点上，自然晾干或用电吹风吹干，点样点直径控制在4mm内。展开及显色:将点好样的滤纸用钉书机(或绳子)将两端固定，使滤纸成圆筒状，置于装有5mm深展开剂的层析缸内，当展开剂前沿离滤纸上端1厘米时将滤纸取出，直接放在80的烘箱中烘烤15min显色。4.实验结果：根据标准谷氨酸和样品中谷氨酸色斑的位置、色斑的亮度来判断样品中谷氨酸的有无以及谷氨酸的含量。5.讨论：测定过程中为什么要使滤纸、溶剂温度等保持恒定？ 试验四 啤酒色度的测定（2学时）一、教学目的：学会分光光度法和目视比色法测定啤酒的色度。二、重点与难点：掌握分光光度法和目视比色法测定啤酒色度的操作过程。三、主要内容：分光光度法：1.啤酒的色泽愈深，则在一定波长下的吸光值愈大，因此可通过吸光度的测定求得啤酒的色度。测试时用1/2min比色杯，在波长430nm下测得吸光度，并换算成啤酒色度。2.材料与仪器：可见光分光光度计；1cm比色杯3.操作步骤：将除气并澄清的啤酒酒样注入1cm比色杯中，以蒸馏水作空白，用可见光分光光度计在波长430nm测定其吸光度A值。4.结果计算：X=101.27A4302.651.2式中：X啤酒色度，EBC单位； 101/2in比色杯在波长430nm下测得的吸光度值转化为啤酒样品色度的转化系数； 1.27-1cm比色杯换算成1/2in比色杯的系数； A430-在波长430nm测得的吸光度； 2.65换算成EBC单位的经验数据； 1.2校正系数。目视比色法：1.原理：啤酒色度的测定以碘液消耗量为标准，取100ml水，向其中滴加0.1mol/L碘液，滴至溶液颜色与啤酒色泽一样，所消耗的碘液体积即为啤酒色度。2.试剂与仪器：0.1mol/L碘标准溶液，比色管。3.测定步骤：选取直径、色泽、管壁厚度均相同的比色管2支，1支准确加入100ml啤酒试样，另一支准确加入100ml水，将2支比色管并列放在白纸上面，置光亮处，用1ml吸管向盛水的比色管内逐滴滴入0.1mol/L碘标准溶液，边滴边搅拌，直至2支比色管色泽相同，记录消耗碘液体积。4.计算：X=Vc/0.1 式中：X-啤酒色度，用0.1mol/L碘标准溶液滴定100ml啤酒试样所消耗碘液的体积，ml； V-滴定消耗碘液的体积，ml； c标定后碘液的浓度，mol/L。讨论：2种方法测得的啤酒色度值是否一致？为什么？试验五 玉米粉中粗纤维素的测定（2学时）一、教学目的：掌握测定发酵原料中纤维素含量的方法步骤。二、重点与难点：掌握对原料进行加酸和加碱处理时的操作方法。三、主要内容：1.原理:在热的稀硫酸作用下，样品中的糖、淀粉、果胶等物质经水解而除去，再用热的氢氧化钾处理，使蛋白质溶解，脂肪皂化而除去，然后用乙醇和乙醚处理来除去单宁、色素及残余的脂肪，所得的残渣为粗纤维素，如其中含有无机物质，可通过测定灰分扣除。2.仪器和试剂仪器:电子天平,电热恒温水浴锅,电热恒温鼓风干燥箱,回流装置,抽提装置试剂:1.25%硫酸溶液:量取7.1ml硫酸，缓慢倒入适量水中，并用水稀释至1000ml；1.25%氢氧化钠溶液：称取1.25g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000ml；乙醚；乙醇。 3 测定方法乙醇处理：准确称量 5-10g玉米粉试样，置入500ml磨口三角瓶中。加入200ml乙醚，盖严，静置24小时，以除去脂肪，用倾泻法除去乙醚层，并用乙醚洗涤残渣，残存少量的乙醚在水浴中蒸发除去。加酸处理：加200ml煮沸的1.25%硫酸溶液于上述500ml三角瓶中，安上冷凝器，在沸水浴中回流30分钟，取下锥形瓶，3000-3500r/min离心10-15分钟，用热水洗涤沉淀至上清液呈中性。加碱处理：将残渣用煮沸的1.25%氢氧化钠溶液转入500ml磨口三角瓶中，补足1.25%氢氧化钠溶液至200ml，安上冷凝器，加热使之微沸，回流30分钟，取下锥形瓶，用4层纱布过滤，用热水洗涤残渣至滤液呈中性，再分别用乙醇、乙醚洗涤一次。干燥、灼烧：将残渣于100-105干燥箱中干燥至恒重，然后再灼烧至恒重。4.计算粗纤维素（以绝干计）=(m1-m2)/m)(1/(1-w)100%式中m1-试样与坩埚干燥至恒重的质量，g;m2-试样与坩埚灼烧至恒重（灰分）的质量，g；m-试样的质量，g；w-风干试样的水分，g；5.讨论测定玉米粉计玉米秸秆中的粗纤维素，应先测定其中的水分，因其参与纤维素的计算。用离心机高速离心，可以解决过去用麻布过滤时，由于其孔径不均匀，测定结果重现性较差的现象。国产粗纤维测定仪，一次测定6个样品，在操作上仅需90分钟，（酸碱处理、抽提、洗涤）。试验六 0.1000mol/L碘标准溶液的配制与标定（2学时）一、教学目的：掌握0.1000mol/L碘标准溶液的配制与标定步骤。二、重点与难点：掌握0.05mol/L Na2S2O3标准滴定溶液的配制与标定过程。三、主要内容：1.原理：先用基准物质K2Cr2O7标定Na2S2O3溶液，再用标定好的Na2S2O3溶液滴定配好的碘液，根据消耗的Na2S2O3溶液体积计算出碘标准溶液的浓度。2.试剂：Na2S2O35H2O，Na2CO3，K2Cr2O7，KI，H2SO4，0.5%淀粉指示剂，I2。配制0.5%淀粉指示剂：称取0.5g可溶性淀粉于100mL烧杯中，用少量水调成糊状，倒入70mL沸水，继续煮沸2min，冷却后用水定容至100mL（临用前现配）。3.方法：c（Na2S2O3）=0.05molL硫代硫酸钠标准滴定溶液：称取13g Na2S2O35H2O和0.1g碳酸钠（Na2CO3），溶于刚煮沸冷却后的蒸馏水中，并用该水定容至1000mL，贮于棕色瓶中密闭保存，放置1周后标定使用。 a标定：称取基准物K2Cr2O7 0.05g（K2Cr2O7 预先在130干燥2h，准确至0.0001g）置于500mL碘量瓶中，用25mL新煮沸并冷却的水溶解，加1g KI及10mL c（12 H2SO4）=2molL的H2SO4溶液，待KI溶解后，于暗处放置10min，加150mL水，用配好的Na2S2O3溶液滴定，接近终点时，加3mL 0.5%淀粉指示剂，继续滴定到溶液由蓝色变为亮绿色时为终点。同时做试剂空白实验。b计算 c（Na2S2O3）=m（V1-V2）0.04903式中c（Na2S2O3）- 硫代硫酸钠标准滴定溶液的实际浓度，molL； m-基准物K2Cr2O7的质量，g； V1-滴定消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积，mL； V2-试剂空白消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积，mL； 0.04903-与 1.00mL硫代硫酸钠标准滴定溶液c（Na2S2O3）=1.000molL相当的重铬酸钾的质量，g；c（12I2）=0.1molL碘标准滴定溶液：称取36gKI溶于50mL水中,在不断搅拌下加入13g碘（I2），完全溶解后用水稀释定容至1000mL，贮于棕色瓶，密闭、避光保存。 a标定：用已标定的c（Na2S2O3）=0.05mol/L Na2S2O3标准滴定溶液标定碘标准滴定溶液。 吸取10.00mL待标定的I2溶液于250mL碘量瓶中，用已标定过的c（Na2S2O3）=0.05mol/L Na2S2O3溶液滴定至淡黄色时，加2-3滴0.5%淀粉指示剂，继续滴定至无色即为终点。b计算c（1/2I2）=cv/10.00式中c（1/2I2）-碘标准滴定溶液的实际浓度，mol/L； c-Na2S2O3标准滴定溶液的实际浓度，mol/L； V-滴定消耗Na2S2O3标准滴定溶液的体积，mL； 10.00-吸取碘标准滴定溶液的体积，mL；4.讨论：结晶的Na2S2O35H2O一般含有少量杂质，同时还容易分化潮解，需用间接法配制。Na2S2O3容易受空气中的O2、溶解在水中的CO2、微生物和光照等作用而分解。它在碱性介质中较稳定。所以配制溶液时，为了减少溶解在水中的CO2和杀灭水中的微生物，使用新煮沸的冷蒸馏水配制溶液，并加入少量碳酸钠，其浓度约为0.02%，以维持溶液的微碱性，防止Na2S2O3的分解。日光能促使Na2S2O3溶液分解，故Na2S2O3溶液贮于棕色瓶中，并放置暗处。长期保存的溶液，应每隔一段时间重新标定。如发现溶液变浑浊（表面有固体析出）时，就应过滤后标定，或重新配制。保存得好，可每两个月标定一次。标定Na2S2O3溶液，常选用强氧化剂如KIO3、KBrO3或K2Cr2O7等作基准物质，这些物质均能与KI反应析出定量的I2。试验七 碘量法测定维C含量（2学时）一、教学目的：掌握碘量法测定样品中维C含量的操作步骤。二、重点与难点：掌握碘量法测定维C含量的原理。三、主要内容：维生素C在乙酸的酸性条件下，可被碘定量氧化。根据消耗碘标准滴定溶液的体积，即可计算出维生素C的含量。1、原理：维生素C在乙酸的酸性条件下，可被碘定量氧化。根据消耗碘标准滴定溶液的体积即可计算维生素C的体积，即可计算维生素C的含量。2、仪器和试剂、仪器 电子天平、试剂a.c(1/2I2)=0.1000molL碘标准滴定液(配制见实验六)b.1淀粉指示剂(配制见实验六)c.c(CH3COOH=1molL乙酸溶液 取6ml冰醋酸用水稀释定容至100ml3、测定方法 称取试样0.2g（称准至0.0001g）于500ml三角瓶中，加新煮沸过的冷水100ml与1molL乙酸溶液10ml使之溶解，加淀粉指示剂1.0ml，立即用碘标准滴定液滴定至溶液显蓝并在30s内不褪色,记录消耗c(1/2I2)=0.1000molL碘标准滴定液的体积。4、计算1ml c(1/2I2)=0.1000molL碘标准滴定液相当于8.806mg的维生素C（C6H8O6）5、讨论（1）操作中加入1molL乙酸溶液可使滴定在酸性溶液中进行。因在酸性介质中维生素C受空气中氧的氧化速度减慢，但样品溶于稀酸后仍需立即进行滴定。（2）加入新煮沸过的冷水的目的是为了减少水中氧对测定的影响（3）中国药典采用本方法对维生素C原料、片剂、泡腾片、颗粒和注射剂进行含量测定，为消除制剂中辅料对测定的干扰，滴定前要进行必要的处理。如片剂溶解后应过滤，取滤液测定；注射液测定时要加2ml丙酮，以消除注射液中含有的抗氧化剂亚硫酸氢钠对测定结果的影响。试验八 蒸馏酒中总醛的测定（2学时）一、教学目的：掌握化学分析法测定蒸馏酒中总醛含量的操作步骤。二、重点与难点：掌握化学分析法测定蒸馏酒中总醛含量的原理。三、主要内容：1.原理:白酒中醛类的羰基与亚硫酸氢钠可起加成反应，反应中剩余的亚硫酸氢钠可用I2氧化，过量的I2用Na2S2O3标准溶液滴定，从空白试验值与酒样值之差求得醛的含量。2. 试剂： C Na2S2O3（硫代硫酸钠）=0.05mol/L硫代硫酸钠标准滴定溶液 称取13g Na2S2O3晶体和0.1g Na2CO3，溶于刚煮沸冷却后的蒸馏水中，并用该水定容至1000ml，贮于棕色瓶中密闭保存，放置1周后标定使用。 C NaHSO3（亚硫酸氢钠）=0.025mol/L NaHSO3溶液 称取2.6g NaHSO3，用水溶解并定容至1000ml（该试剂不稳定，须现用现配）。 C（）=0.1mol/L碘标准滴定溶液 称取36g KI溶于50ml水中，在不断搅拌下加入13g I2，完全溶解后用水稀释定容至1000mL，贮于棕色瓶，密闭、避光保存。 0.5%淀粉指示剂 称取0.5g可溶性淀粉于1000ml烧杯中，用少量水调成糊状，倒入70沸水，继续煮沸2min，冷却后用水定容至1000ml（临用前现配）。3.测定方法：吸取待测酒样50.0ml，置于250ml碘量瓶中，准确加入20.00ml C（NaHSO3）=0.025mol/L NaHSO3溶液，于暗处反应30min，其间需经常摇动以利反应进行。准确加入25.0ml C（）=0.1mol/L碘标准滴定溶液，摇匀，立即用C（Na2S2O3）=0.05mol/L Na2S2O3标准滴定溶液滴定至浅黄色，加1.00ml 0.5%淀粉指示剂，再继续滴定至蓝色消失。同时做试剂空白试验，不加酒样，其余操作同上。4.计算：总醛（以乙醛计，g/100ml）=（V-）C（Na2S2O3）0.2203100/50.0式中 V-试样测定时消耗Na2S2O3标准滴定溶液的体积，ml； -空白试验时消耗Na2S2O3标准滴定溶液的体积，ml；C（Na2S2O3）- Na2S2O3标准滴定溶液的实际浓度，mol/L；02203-与1.00ml Na2S2O3标准滴定溶液c（Na2S2O3）=1.000mol/L相当的乙醛的质量，g。5.讨论：NaHSO3极不稳定，用后需密封防潮；NaHSO3溶液要现用现配，然后用C（）=0.1mol/L碘标准溶液滴定；用Na2S2O5（偏重亚硫酸钠）代替NaHSO3效果较好，因为Na2S2O5较NaHSO3稳定得多，且作用相同。试验九 蒸馏酒中总脂的测定（2学时）一、教学目的：掌握测定蒸馏酒中总脂含量的操作步骤。二、重点与难点：掌握测定蒸馏酒中总脂含量的原理。三、主要内容：1.原理：先用碱（NaOH）中和蒸馏酒中的游离酸，再加入一定量的碱（NaOH）使脂皂化，过量的碱（NaOH）再用酸（H2SO4）进行反滴定，然后计算出脂的含量。 2NaOH+H2SO4Na2SO4+2H2O2.仪器和试剂（1） 仪器 电子天平（0.1mg）；电热恒温水浴锅；全玻璃回流装置（250ml）。（2） 试剂C(NaOH)=0.1mol/L 标准滴定溶液 称取4g NaOH,用水溶解并稀释定容至1000mL.a.标定：准确称取0.4g(称准至0.0001g)邻苯二甲酸氢钾（预先于120烘2h）,置入250 mL三角瓶中，加50 mL水使其溶解，加2滴0.5%酚酞指示剂，用待标定的NaOH溶液滴定至微红色，30s不褪色即为终点。同时做一空白试验。b.计算CNaOH=mV1-V20.2042式中m邻苯二甲酸氢钾的质量，g;V1滴定消耗NaOH标准滴定溶液的体积，mL；V2空白试验消耗NaOH标准滴定溶液的体积，ml;0.2042与1.00mlNaOH标准滴定溶液c(NaOH)=1.000mol/L相当的邻苯二甲酸氢钾的质量，g。c(1/2 H2SO4)=0.1mol/L H2SO4标准滴定溶液 量取2.8ml浓H2SO4，用水稀释至1000ml.a标定：吸取20.00,ml待标定的硫酸溶液，置入150ml三角瓶中，加2滴0.5%酚酞指示剂，用已标定过C(NaOH)=0.1mol/L NaOH标准滴定溶液滴定至微粉色，30s不褪色即为终点。b计算 c12H2SO4=c(NaOH)v20.00式中 c12H2SO4 硫酸标准滴定溶液的实际浓度，mol/L;C(NaOH)NaOH标准的滴定溶液的实际浓度，mol/L;V消耗NaOH标准滴定溶液的体积，ml。0.5%酚酞指示剂 称取0.5g酚酞，溶于100ml 95%乙醇中。3.测定方法吸取酒样50.0ml置于250ml磨口三角瓶中，加入2滴0.5%酚酞指示剂，用C(NaOH)=0.1mol/L NaOH标准滴定溶液滴定至微粉色，切忌过量记录消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积V1（ml）.再准确加入C(NaOH)=0.1mol/L NaOH标准滴定溶液25.00ml，摇匀，置沸水浴中回流30min（用球形冷凝管），取下后冷却至室温，用c(1/2 H2SO4)=0.1mol/L H2SO4标准滴定溶液进行反滴定，使微红色刚好完全消失为终点，记录消耗c(1/2 H2SO4)=0.1mol/L H2SO4标准滴定溶液的体积V2（ml）。4.计算总酯（以乙酸乙酯计，g/L）=cNaOH25.00-c(1/2 H2SO4)V250.00.088121000式中C(NaOH)NaOH标准的滴定溶液的实际浓度，mol/L;25.00皂化时加入NaOH标准滴定溶液的体积，ml;c12H2SO4 硫酸标准滴定溶液的实际浓度，mol/L;V2反滴定时消耗硫酸标准滴定溶液的体积，ml;0.08812与1.00mlNaOH标准滴定溶液c(NaOH)=1.000mol/L相当的乙酸乙酯的质量，g。50.0取样体积，ml;结果的允许误差：同一样品两次测量的结果相差不得超过0.006g/L,结果保留两位小数。5.讨论(1).皂化时加入NaOH的量，视白酒中总酯的含量而定，如总酯含量大于0.4%时，0.1mol/LNaOH溶液需加入30ml。 皂化条件的改变影响总酯测定的结果，通常皂化工程如采用静置过夜，则其结果比采用沸水浴回流30min偏低。(2).本测定方法是国家标准（GB 10345.5-89）试验方法，是检测酯类的经典的化学方法，适用于各种香型白酒中总酯的测定。现在可用气相色谱法对白酒中各种酯类分别进行定性定量。(3).该测定方法可同时测定白酒中的总酸含量。若以乙酸计，可表示为： 总酸（以乙酸计，g/L）=cNaOHV150.00.060061000(4).若采用气相色谱法，可将蒸馏酒中的各种酯分离后定量，具体方法参见“17 成品酒精中甲醇、醛高级醇、酯的测定”。(5).长期饮用总酯含量过高的蒸馏酒，对饮用者身体健康可能会造成影响，这又增加了测定蒸馏酒总酯的意义，故应严格控制蒸馏酒中总酯的含量。(6).NaOH与邻苯二甲酸氢钾反应方程式为：试验十 乳酸纯度的测定（2学时）一、教学目的：掌握测定总酸含量的操作步骤。二、重点与难点：掌握测定总酸含量的原理。三、主要内容：乳酸含量实际上是指乳酸发酵产物的纯度，采用碱中和酸，测得的应是总的乳酸含量，即乳酸纯度。1. 原理试样与过量NaOH反应，剩余的NaOH以酚酞为指示剂，用标准滴定溶液滴定。2. 试剂1 C(NaOH)=1mol/L NaOH 标准滴定溶液 称取 4g NaOH，加水溶解并定容至100mL。标定：准确称取4g（称准至0.0001g）邻苯二甲酸氢钾（预先于120干燥2h），置于250ml三角瓶中，加50mL新煮沸过的冷水，振摇使溶解，加2滴0.5%酚酞指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定至微红色，30s不褪色即为终点。2 c()=0.5mol/L 标准滴定液 量取2.8mL ,加入已盛有少量水的100mL容量瓶中，并用水定容至刻度。标定：吸取20.00mL硫酸标准滴定溶液，置于150mL三角瓶中，加2滴0.1%甲基红指示剂，用已标定过的NaOH标准滴定溶液（0.1mol/L）滴定至黄色。3 1%酚酞指示剂 称取1.0g酚酞，溶于100mL95%乙醇溶液中。3. 测定称取样品1.0000g（称准至0.0001g），加50mL水，准确加入c(NaOH)L=1mol/LNaOH标准滴定溶液40.00ml，煮沸5min，加2滴1%酚酞指示剂，趁热用c()=0.5mol/L 标准滴定液滴定至无色。同时做试剂空白试验。4.计算 乳酸（质量分数）=式中 空白试验消耗标准滴定溶液的体积，mL； 试样消耗标准滴定溶液的体积，mL； c标准滴定溶液的实际浓度，mol/L； m试样的质量，g；0.09008与1.00ml标准滴定溶液c()=0.5mol/L相当的乳酸的质量，g。5. 讨论1 本方法源于GB 2023-2003，作者有改动；乳酸GB 2023-2003理化指标见表27-1。2 L-乳酸生产工艺如下：原料粉碎调浆糊化液化糖化过滤发酵除杂酸解脱色净化浓缩离子交换浓缩成品。表27-1 乳酸GB 2023-2003理化指标项目指标L(+)-乳酸DL-乳酸乳酸含量（质量分数）/%8090色度（APHA）50150L(+)-乳酸占总酸的含量（质量分数）/%95-氯化物（以氯离子计）/%0.002硫酸盐（以硫酸根计）/%0.005铁盐（以Fe计）/%0.001灼烧残渣/%0.1砷（以As计）/(mg/kg)1重金属（以Pb计）/(mg/kg)10钙盐合格易炭化物合格-醚中溶解度合格柠檬酸、草酸、磷酸、酒石酸还原糖甲醇/%0.2-氰化物/(mg/kg)5试验十一 常压干燥法测定玉米粉和谷氨酸中水分含量（2学时）一、教学目的：掌握水分测定的各种方法，熟练掌握常压干燥测定水分的操作技能。二、重点与难点：掌握蒸发、干燥、恒重的概念和知识。三、主要内容：1.原理：食品中的水分一般是指在常压下、100-105C直接干燥的情况下或在减压条件下、55-70所失去物质的总量。实际上在此温度下所失去的是水和挥发性物质的总量，而不完全是水。直接干燥法适用于在95105C下，不含或含其他挥发性物质甚微的样品。本试验采用直接干燥法测试玉米粉和谷氨酸中的水分含量。2.仪器和材料：玉米粉、谷氨酸、电热恒温鼓风干燥箱、电子天平（0.1mg）、称量瓶、干燥器。3.测定方法：取洁净的称量瓶，置于100-105C电热恒温鼓风干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，干燥2h，盖好取出，立即放入干燥器内冷却30min，称重。再放入100-105C干燥箱中干燥1h，盖好取出，放入干燥器内冷却30min，称重。重复干燥至恒重（前后两次质量差不超过0.5mg）。准确称取5g玉米粉、谷氨酸样品于上述已恒重的称量瓶中，置于100-105C干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，干燥3h，盖好取出，立即放入干燥器内冷却30min，称重。再放入100-105C干燥箱中干燥2h，盖好取出，放入干燥器内冷却30min，称重。重复干燥至恒重。4.计算水分=(m1-m2)/(m1-m0)100 式中，m0称重瓶的质量，g； m1称重瓶和样品干燥前的质量，g; m2称重瓶和样品干燥后的质量，g。5.讨论本法操作简单，结果准确，但比较费时，且不适合胶体、高脂肪、高糖样品及含有较多的高温易氧化、易挥发物质的样品。本法测得的水分实际上还应包括微量的芳香油、醇、有机酸等挥发性物质。操作过程中，须戴手套，否则称量瓶难恒重。本法最低检出量为0.002g，取样量为2g，本法检出限为0.10g/100g，方法相对误差5%。试验十二 啤酒中双乙酰的测定（2学时）一、教学目的：掌握比色法测定双乙酰含量的操作步骤。二、重点与难点：掌握水蒸汽蒸馏的基本原理和操作，掌握紫外分光光度计的操作要求。三、主要内容：1.原理：本实验采用比色法测定双乙酰。通过水蒸气蒸馏初步分离得到双乙酰，邻苯二胺与包括双乙酰的连二酮类物质反应，生成物的盐酸盐在335nm有最大吸收，其吸收度与联二酮的浓度成正比，依此可进行定量测定。2. 仪器和试剂：仪器：电子天平（0.1mg)；紫外可见分光光度计（应符合或高于GB 9721的要求）；半微量凯氏定氮蒸馏装置（100mL)。试剂：消泡剂（有机硅消泡剂或甘油聚醚）；4mol/L盐酸溶液（量取34mL浓HCl，用水定容至100mL）；1%邻苯二胺溶液（准确称取0.5g邻苯二胺，溶于4mol/L HCl溶液中，并以4mol/L HCl溶液定容至50mL，贮存于棕色瓶中，宜当天配制）；0.5000mg/mL双乙酰贮备液（称取0.5000g优级纯双乙酰，用水稀释定容至1000mL，贮于棕色瓶中，冰箱保存，最好现配现用）；0.2500mg/mL双乙酰标准溶液（吸取双乙酰贮备液5.00mL于25mL具塞比色管中，用水稀释至10.0mL)3.测定方法：蒸馏 于25mL具塞比色管内加约2.5mL 水，置于冷凝器下端，使冷凝器下端浸入水中。量取未除气的啤酒100.0mL，加2-4滴消泡剂，迅速加入到已预先加热的蒸馏器中，用少量水冲洗加样口，并作水封。继续加热蒸馏至馏出液近25mL。取下比色管，以水定容至25mL，混匀。显色 分别取10.00mL馏出液，置于两支25mL具塞比色管中，向1号管加入0.5mL1%邻苯二胺溶液，2号管不加（做空白）。充分摇匀，放置暗处反应20-30min。向1号管中加入2.00mL 4mol/L HCl溶液，2号管中加2.50mL 4mol/L HCl溶液，摇匀。同时准确吸取0.10mL 0.2500mg/mL双乙酰标准溶液于25mL具塞比色管中，用水稀释至10.0mL。加入0.5mL 1%邻苯二胺溶液，充分摇匀，放置暗处反应20-30min。加入2.00mL 4mol/L HCl 溶液。比色 于335nm波长下，用2cm的石英比色皿，以空白做参比，用紫外可见分光光度计测出样品和双乙酰标准溶液的吸光度，比色操作需在20min内完成。4.计算：联二酮（以双乙酰计，mg/L)=0.625无双乙酰标准品，可按下式计算：联二酮（以双乙酰计，mg/L)=A1.2-0.01式中 A-试样的吸光度； 1.2-吸光度与双乙酰换算系数(多次用纯双乙酰测得的经验数据）； 0.01-校正数（本法与Duades和Drews 法比较得出的差值），可略去。5.讨论双乙酰不易纯化，市售双乙酰需测定纯度。双乙酰纯度测定方法：吸取1mL双乙酰贮备液，稀释定容至100mL，吸取10mL该稀释液（含双乙酰50ug/mL），按21.3节中的（2）、（3）测定其浓度。蒸馏时加样要迅速，勿使成份损失，而且要尽快蒸出，最好在5min内完成。如果蒸馏器体积小，或消泡剂效果差时，可将100mL试样分两次蒸馏（接收在同一支比色管内），调节蒸汽量，控制蒸馏强度，勿使泡沫过高而被蒸汽带出。试样蒸馏结束后，加入稀碱液煮沸，以除去附着在容器壁上的残渣，再用热水冲洗至中性。显色反应宜在暗处进行，如在光亮处可导致结果偏高。试验十三 啤酒中甲醛残留量的测定（2学时）一、教学目的：掌握变色酸法测定甲醛残留量的操作步骤。二、重点与难点：掌握蒸馏的基本原理和操作，掌握紫外分光光度计的操作要求。三、主要内容：1.原理：甲醛在酸性条件下从试样中蒸出，在H2SO4存在下可与变色酸（1,8-二萘酸-3,6-二磺酸）反应生成紫色化合物。该化合物在575nm处有最大吸收，甲醛含量在一定范围内与其吸光度值呈线性关系，故可利用标准曲线对甲醛定量。2.仪器和试剂（1） 仪器 凯氏定氮蒸馏装置（500ml)；紫外可见分光光度计（应符合或高于GB9721要求）（2） 试剂 磷酸（H3PO4) 磷酸原装试剂 5变色酸（1,8-二萘酸-3,6-二磺酸）溶液称取2.5g变色酸（或变色酸钠盐）于100ml烧杯中，用约30ml水完全溶解后，定容至50ml。如不澄清，需要过滤。冰箱保存，一周内有效。 变色酸试剂 吸取2.00ml5变色酸溶液于100ml容量瓶中，用浓H2SO4定容至刻度。 c(H2SO4)=0.5mol/L硫酸溶液 量取28ml浓硫酸，缓慢倒入适量水中，用水稀释至1000ml。 c(I2)=0.1mol/L碘溶液 称取13.5g I2,加36gKI、50mlH2O,溶解后加入3滴盐酸及适量水稀释至1000ml。用垂融漏斗过滤，置于阴凉处，密闭、避光保存。 c(Na2S2O3)=0.1mol/L硫代硫酸钠标准滴定溶液 称取约25g硫代硫酸钠（Na2S2O35H2O）和0.2g碳酸钠（Na2CO3）溶解于新煮沸冷却后的水中，并定容至1000ml，贮于棕色试剂瓶中，一周后标定。 a.0.1mol/L Na2S2O3溶液的标定：称取基准物K2Cr2O7 0.1g（K2Cr2O7）预先于130干燥2h，准确至0.0002g)置于500ml碘量瓶中，用25ml新煮沸并冷却的水溶解，加2gKI及20mlc(H2SO4)=2mol/L的H2SO4溶液，待KI溶解后，于暗处放置10min，加150ml水，用配好的Na2S2O3溶液滴定，接近终点时，加3ml5淀粉指示剂，继续滴定到溶液由蓝色变为亮绿色时为终点。同时做试剂空白试验。b.计算c（Na2S2O3）= 式中c（Na2S2O3）硫代硫酸钠标准滴定溶液的实际浓度，mol/L；m基准物K2Cr2O7的质量，g；滴定消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积，ml；试剂空白消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积，ml；0.04903与1.00ml硫代硫酸钠标准滴定溶液c（Na2S2O3）=1.000mol/L相当的重铬酸钾的质量，g。 甲醛（HCHO)标准贮备液 吸取3638的HCHO7.0ml,加0.5ml0.5mol/L的H2SO4溶液，定容至250ml。用碘量法标定其浓度。a.甲醛（HCHO）标准贮备液的标定：吸取10.00mlHCHO标准贮备液于100ml容量瓶中，用水定容至刻度。吸取稀释后的HCHO溶液10.00ml于500ml碘量瓶中，加90ml水，加20.0ml0.1mol/L碘溶液，放置15min。用0.1mol/L Na2S2O3标准滴定溶液滴定至溶液至浅黄色，加3.0ml0.5淀粉指示剂，继续滴定至溶液由蓝色转变为无色透明。用水代替甲醛溶液，做空白试验。b.计算甲醛（mg/ml)=式中空白试验消耗Na2S2O3标准滴定溶液的体积，ml；试样消耗Na2S2O3标准滴定溶液的体积，ml；CNa2S2O3标准滴定溶液的实际浓度，mol/L；15.00与1.00ml Na2S2O3标准滴定溶液c（Na2S2O3）=1.000mol/L相当的重铬酸钾的质量，mg。 甲醛（HCHO)标准使用液 用HCHO标准贮备液准确稀释至1mol/L。3.测定方法(1)、试样制备 将啤酒反复倾倒除去泡沫后，取200.0ml试样于500ml凯氏烧瓶中，加1ml H3PO4，加几粒沸石，连接凯氏定氮蒸馏装置，慢慢蒸馏，收集蒸馏液50.0ml（可将50ml容量瓶置于冰水浴中）。(2)标准曲线的绘制 分别吸取HCHO标准稀释液（1mol/L）0、0.20ml、0.40ml、0.80ml、1.20ml、1.60ml、2.00ml于25ml具塞比色管中，加水补至10.0ml。向各管缓慢加入变色酸试剂10.00ml，摇匀。充分冷却后，在波长575nm下，用3cm比色皿，以试剂空白做参比，测定吸光度。依据吸光度与甲醛浓度的线性关系，建立线性回归方程，求得甲醛浓度。(3)测定 吸取10.00ml制备试样于25ml具塞比色管中，按标准曲线的绘制显色，测定吸光度。4.计算啤酒中甲醛含量（mg/l)=式中c根据线性回归方程计算出的甲醛浓度，ug/10ml；取样体积，ml；啤酒试样体积，ml；啤酒蒸馏液体积，ml。5.讨论制备试样时，用调压电热套加热快速安全。蒸馏开始时电热套电压应调低些，以防突然暴沸。用Na2S2O3溶液标定甲醛标准贮备液时，加入0.5%淀粉指示剂前的浅黄色判断要准确，否则将带来很大的误差。配制变色酸试剂时，因为浓H2SO4遇水大量放热，所以最初浓H2SO4须慢且少量加入并及时混匀，每次都要充分冷却后再继续缓慢少量加入。试验十四 酱油中氨基酸态氮的测定（2学时）一、教学目的：掌握甲醛法测定氨基酸含量的方法。二、重点与难点：掌握PH计的操作方法。三、主要内容：1.原理：氨基酸是具有氨基和羧基的两性化合物，不能用氢氧化钠直接滴定，采用加入甲醛溶液，使氨基的碱性被掩蔽，呈现羧基酸性，再用氢氧化钠滴定。反应式为： N-二羟甲基氨基酸 2. 仪器和试剂 （1）仪器 酸度计；磁力搅拌器；电子天平（0.1mg） （2）试剂 甲醛（HCHO）溶液 体积分数（36%-38%） c(NaOH)=0.05mol/L 氢氧化钠标准滴定溶液 称取2.0gNaOH，用水溶解并稀释至1000ml。3. 测定方法 准确吸取5.00ml酱油，用水稀释定容至100ml。吸取20.00mL酱油稀释液，置于100ml烧杯中，加60ml水，搅拌下用0.05mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH8.20，此为游离酸度，不予计量（但若测定总酸，可直接利用次滴定体积）。加10.0ml HCHO溶液，开动磁力搅拌器，立即用0.05mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH9.20，记录消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积。 另取80ml水，不加酱油稀释液，同上操作，进行空白试验。4. 计算 氨基酸态氮(g/100mL)=(V-V0)*0.01401*100/20*1/5*100式中 V加甲醛后式样消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，ml； V0加甲醛后空白消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，ml； c氢氧化钠标准滴定溶液的实际浓度，mol/L；0.01404与1.00ml氢氧化钠标准滴定溶液c(NaOH)=1.000mol/L 相当的氮的质量，g；100/2020 为吸取酱油稀释液的体积，ml；100 为酱油稀释后体积，ml； 5吸取酱油的体积，ml。 同一样品两次平行测定之差，不得超过0.03g/ml。5. 讨论 本方法源于酿造酱油GB/T 18186-2000中氨基酸的测定。 氨基酸是一种两性电解质，不能直接用酸或碱滴定，是因为酸、碱滴定时其等电点的pH值过高（pH 12-13）或过低（pH 1-2），单一的指示剂难以满足要求。酱油中氨基酸态氮测定采用甲醛法，因为一般化学法不能将氨基酸分离，只能通过测定氨基酸态氮的方法定量。甲醛法又分为指示剂滴定法和电位滴定法。滴定终点（加甲醛后）确定在pH 9.20，是因为氨基酸溶液中存在1mol/L甲醛时，滴定终点冲pH 12左右移至pH 9附近，亦即酚酞指示剂的变色区域，这也是甲醛滴定法的基础。电位滴定法也同指示剂一样，由于滴定终点标准不同而检测结果有差异，个别终点掌握在pH 9.00，所以报告时最好注明检测方法及终点的pH值。甲醛法测定酱油中氨基酸态氮，除氨基酸态氮外别的氮也可起反应，故仍有误差。另外由于各种氨基酸的等电点不同，故确定一个