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化学计量学方法应用于中药化学特征指纹图谱应用化学 2008级 学号20086119 李成远任课教师 印家健 副教授摘要：中草药化学特征指纹图谱一般指的是一条包含许多化学组分的复杂色谱曲线。通常情况下，借助分离度(Resolution，R)与相对峰面积(Relative peak area，RPA)等来作为评价其分离质量的量化标准。关键词：特征指纹图谱,分离度,相对峰面积, 分离质量由于中草药能表现出一定的药理活性与临床疗效，几千年来它们一直都被广泛应用。然而，由于中草药及其复方制剂太复杂，所含的化学成分众多1,2，且含量一般都很低，导致对中草药及其复方制剂不可能进行全面定性定量检测，通常情况下，仅仅通过对其中几种标示性化学成分的测定来监控中草药及其复方制剂的质量。所以，建立中草药化学特征指纹图谱的方法且前已成为国际上公认的控制中草药或天然药物质量的最有效方法，该技术也必将成为控制中药生产工艺标准化的最有力手段。显然，获得一个高质量的中草药化学特征指纹图谱是其中的一个关键。本文以川芎的氯仿提取物的HPLCDAD分析检测为实例，对一些常用的中草药化学特征指纹图谱分离质量的方法进行了讨论，同时，借助化学计量学中有关数据的提取与处理、信息基础理论等手段，提出了一些新的定量评价中草药化学特征指纹图谱分离质量的方法。本文提出了另外一个经验指标参数，并根据化学计量学中有关的信息基础理论，提出了其它新的定量评价标准。1 理论基础 11 分离度(Resolutioa，R)指标参数分离度(Resolution，R)是一个描述相邻两个色谱峰分离程度的重要参数，它与该相邻两个色谱峰的保留时间与峰的宽度有关3,4。在Fig1a中，两对相邻色谱峰之间的分离度(Resolution，R)可以按如下公式分别进行计算：R(1，2)=2(t2t1)(Wl+W2) (1)R(2，3)=2(t3一t2)(W2+W3) (2)这里，R(1，2)与R(2，3)分别代表两对色谱峰，即第一、二个色谱峰之间，第二、三个色谱峰之间的分离度，t与W则分别表示第j个色谱峰的保留时间与峰宽度。由以上两个公式可知，R是一个没有量纲的参数。根据以上分离度的定义，如果两个相邻色谱峰之间的分离程度越高，其分离度值就越大，据此，对于一个包含有超过两个色谱峰的色谱曲线来说，可以定义一个新的参数SR(Stun of resolution)，即所有相邻两个色谱峰之间的分离度R之和，用此参数来表示该色谱益线的分离程度。在Figia中，SR是R(1，2)与R(2，3)之和。显而易见，对于一个包含许多色谱峰的中草药化学特征指纹图谱来说，如果其SR值较大，则说明构成该特征图谱的色谱峰之间具有较高的分离程度。1.2 相对峰面积之和(Sum of relative peak area，SRPA)指标参数 基于BeerLambert定律，在一定的条件下，某一化学组分所对应的色谱峰的面积与该组分的质量成正比，因此，色谱峰面积是色谱分析检测中一个重要的定量指标参数，显然，该参数同样适合于中草药化学特征指纹图谱中所对应的化学成分的定量检测。在理想的情况下，若一个中草药化学特征指纹图谱中的所有化学组分都得以完全分离，通过计算出各个组分所对应的色谱峰的峰面积，从而实现对中草药中的相应化学成分的定量检测。然而，在大多数情况下，中草药化学特征指纹图谱中的许多色谱峰实际上与相邻组分的色谱峰发生了重叠，这就导致它们的实际色谱峰面积之和远小于真实值。从Fig1b中可以看出，由于三个色谱峰并没有完全分离，存在两个共同的重叠区域A2.1与A3.2。它们的实际色谱蜂面积之和为(A1+A2+A3一A2.1一A3.2)，而真实值应该是(A1+A2+A3)，这样因发生了相邻色谱峰的重叠而使得实际色谱峰面积之和减少了A2.1+A3.2。为了进行更好的比较，可以将具有最大色谱峰面积的色谱峰，如Fig，lb中的第二个色谱峰，或者其它参比色谱峰的峰面积之值置为1，从而计算出其它色谱峰的相对峰面积，这样，对于Fig1b中的色谱峰族来说，因存在色谱峰的重叠区域，其相对色谱峰面积之和比真实值要小。据此，对于中草药化学特征指纹图谱的实际色谱曲线，所有色谱峰的相对峰面积之和在一定程度上可以反映出指纹图谱中所包含的化学组分的分离程度，即该中草药化学特征指纹图谱的分离质量。1.3 与分离度(Resolution，R)及相对峰面积之和(Sum of relative peak area，SRPA)相关的经验指标参数WSK根据以上的讨论，一个中草药化学特征指纹图谱的分离质量在一定程度上与分离度R及相对峰面积之和SRPA有关。综合考虑这两个因素的影响，提出了一个新的经验参数WSK，其表达式为： (3)该经验参数同样与分离度R及相对峰面积之和SRPA有关。1.4 基于互信息(Mutual Information)的指标参数有关基于信息理论的互信息函数(Function of mutual information，MuI)应用于色谱分离体系检测条件的优化，在许多文献中已经作了较为详细的说明，在此，仅对互信息函数MUI作简单的讨论。通常，对一个分析体系的色谱分离检测，其测定方法的优劣可以用分析体系中包含的化学组分所获得的精确度以及总的分析效率来表示，其中，待测组分的精确度尤为重要。在一个色谱分析体系中，如果第j个组分的精确度用它的相对标准偏差(Relative standard deviation，RsD)来表示，那么该组分通过色谱检测所获得的信息量与其精确度有如下关系：=log(IRSDj)(j=1， NP) (4)这里，电表示第j个组分所获得的信息量，NP是整个色谱曲线中能够观察到的色谱峰的数目。显然，如果第j个组分通过色谱检测后获得的信息量越多，那么该组分的相对标准偏差就会偏低，因而具有较高的色谱分离质量。对于一个包含有许多化学组分的中草药化学特征指纹图谱来说，总的信息量可用下式来表示：=j=log(1RSDj(j=1，NP) (5)因此，中草药化学特征指纹图谱总的m值越高，其相对误差越小，从而表现出较高的色谱分离检测质量。值得注意的是，对于一个复杂的中草药化学特征指纹图谱，如果某个色谱与它们的相邻色谱峰发生了重叠，就要首先确定该色谱峰的纯组分区域与重叠区域，然后才能准确计算出该色谱峰对应的化学组分所获得的信息量。对于大多数商用色谱仪器来说，通常采用垂直分割的手段来近似处理重叠色谱峰，同时，将分割后的色谱峰均看作纯组分色谱峰。在本文中，对于中草药化学特征指纹图谱重叠色谱峰所对应的化学组分获得的互信息量的计算，也采取完全相同的近似处理，计算用的所有数据直接来自于商用色谱仪器的数据分析操作系统。2 实验部分2.1 川芎的氯仿提取称取约05 g川芎粉末，加人氯仿30mL，再加入一定量氨水使其pH值为9，然后用高速搅拌机以11000 drain搅拌提取2min，滤过，用氯仿定容至50 mL。2.2 色谱条件色谱柱：Lichrosorb RP18(Hewlett Packard)(250 m46 mm，ID)；流动相：起始CH30H：H2O=10：90(，vv)，到60 min时，线性变化到CH30H：H2O=100：0(，VV)；流速：07ml/min ;(4)柱温：25；波长扫描范围：190400 nm。3 结果与讨论 Fig2 a，2 b，2 C，2 d，2 e分别是川芎的氯仿提取物用HPLCDAD检测在225，254，280，295，320 nm下所得到的化学特征指纹图谱。从这五个色谱曲线图中可以看出，在Fig2 a图中直接观察到的色谱峰数目最多，而在Fig2 e色谱图中却只观察到较少数目的色谱峰，其它三个图中的色谱峰数目基本上差不多。Table 1中列出了在各个波长下所有色谱峰的保留时间值，它们分别可以观察到57，41，43，39与26个色谱峰。需要说明的是，以上所有这些数据均直接来源于商用仪器的数据分析系统，没有经过其它任何数据处理过程。根据以上在五个不同波长下观察到的色谱峰数目，可以初步判断在225 nm下的化学特征指纹图谱对化学组分具有较高的分离质量，而在320 nm下的指纹图谱的分离质量是最差的，但对于其它三个波长下的化学特征指纹图谱，不能直接作出客观的比较。基于以上理论部分的有关算法，可以分别计算出在五个不同波长下所获得的化学特征指纹图谱的SRPA，SR，MR(分离度的平均值)与WSK之值(见Table 2)。根据Tahie 2，在225 nm下的化学特征指纹图谱，除了MR值以外，其余的指标参数如SRPA，SR与WSK均具有最高值，而在320 nm下的情况正好相反。据此可以说明，225 nm下的指纹图谱的分离质量要高于其它波长下的色谱曲线，在320 nm下的色谱曲线对化学组分应该具有最差的分离程度，该结论与以上的目溯结果是基本相同的。然而，对于其它三个波长下的化学特征指纹图谱，它们的四个指标参数SRPA，SR，MR与WSK之值十分接近，且其大小顺序并不完全一致，这就导致使用这四个指标参数去评价这三个波长下的化学特征指纹图谱的分离质量存在一定的困难。需要指出的是，在一个化学特征指纹图谱中，如果所分离出来的色谱峰数目较少，就有可能反而具有较高的平均分离度，因此，分离度的平均值MR指标参数不可能真实地反映出化学特征指纹图谱的分离质量，以上在320 nm下的化学特征指纹图谱的情况可以很好地说明这一结论。根据以上有关信息基础理论中互信息量的计算，其结果(见Tabte 3)清楚地表明，在五个化学特征指纹图谱中，225 nm下的色谱曲线对化学组分具有最高的分离质量，而320 nm下的指纹图谱分离质量最差，该结论与以上根据其它指标参数所得到的结果是完全一致的。其它三个波长下的化学特征指纹图谱，它们的互信息量介于前两者之间。对于Inform 1来说，这三个波长下的互信息量基本相等，虽然其大小顺序依次为280、254、295 nm，但因其差别太小，可能对三个波长下的化学特征指纹图谱的分离质量的好坏难以作出准确的判断。至于根据Inform 2与Inform 3的计算结果，都可以清楚地说明三个波长下的化学特征指纹图谱的质量高低顺序为280、254、295nm，与以上Inform l大小顺序是完全一致的，因此，互信息量的三个不同表达方式在本质上是一致的，都能客观地评价不同检测条件下得到的中草药化学特征指纹图谱的分离质量。表1 表 2 参考文献 1 Yan XinjianZhou JiaJu，Xie Guimlllg and Milne GWA Traditional Chinesel Medicines; 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